Použití lidského biologického materiálu ve
výzkumu 2015
Rudolf Nenutil
Masarykův onkologický ústav
Oddělení onkologické a experimentální patologie
RECAMO
Souhrn:
Proč se ve výzkumu používá lidský biologický materiál
Kde a za jakých podmínek se sbírá
Zpracování tkáňových vzorků a vhodnost jejich použití pro různé metody
Jak se materiál archivuje a vydává
Data sdružená s biologickým materiálem
Prognostické a prediktivní parametry
Korelace biologických parametrů s klinickými daty
Proč:
Možnosti a experimentální výtěžnost buněčných modelů in vitro jsou omezené
samotná kultivace je selektivní
je velmi obtížné napodobit mikroprostředí
je prakticky nemožné napodobit interakci s imunitním systémem
Je třeba ověřit zda nepracujeme s artefakty
jsou výsledky zobecnitelné pro určitý typ nádorů ?
existuje jejich korelace s klinickými daty ?
mají potenciální význam pro použití v diagnostice nebo léčbě ?
Proč – tkáň má více složek
Proč:
Našli jsme potenciální cíl protinádorové léčby..
- vyskytuje se cílový protein v reálných nádorech, kterých, jak často ?
- jak moc je cíl specifický pro nádorové buňky ?
- liší se nádory které ho mají/nemají v klinické odpovědi na léčbu ?
Našli jsme potenciální marker rezistence na určitou léčbu
- vyskytuje se v reálných nádorech, kterých, jak často ?
- liší se nádory které ho mají/nemají v klinické odpovědi na léčbu ?
Nebo obráceně:
Našli jsme protein který je rozdílně exprimován v nádorech s různou klinickou
odpovědí na léčbu, případně mezi nádorem a nenádorovou tkání
- je nutno ověřit na rozsáhlejším, případně nezávislém souboru
- jeho funkci je nutno validovat a detailněji prozkoumat na buněčných
modelech
Materiál nejlépe zajistí klinický patolog
Angloamerický obor nezavedený v našem zdravotnictví
(„Department of Pathology and Laboratory Medicine“)
V ČR biochemie, hematologie, mikrobiologie, imunologie,
histopatologie, genetika)
Prakticky všechen lidský materiál odebraný pro diagnostické
nebo léčebné účely prochází přes tato oddělení. Velmi často
jsou z něj redundantní zbytky
Biologický materiál
Krev
Moč, stolice, sputum, sliny
Mikrobiologické stěry
Výpotky
Cytologické stěry a punkce
Tkáně
punkční biopsie
mikroexcize
operační biopsie
Klinická biochemie
Hematologie
Mikrobiologie
Klinická genetika
Patologie
Zpracování krve
Krev Separace lymfocytů Cytogenetika
Genomová diagnostika
Koagulace a separace Sérové markery
Blokáda koagulace
Separace složek
Plasma, markery
Biopsie
DEFINICE:
Diagnostické histomorfologické vyšetření orgánů a tkání živých
pacientů (= máme k dispozici informaci o struktuře tkáně)
TYPY BIOPTICKÉHO VYŠETŘENÍ:
Mikrobiopsie – („zavřená biopsie“)
- punkční silnou jehlou („core needle“)
- endoskopická excize
Biopsie otevřená
- diagnostická excize, mikroexcize
- vyšetření chirurgického resekátu
Cytologie
„fine needle aspiration, smear“
DEFINICE:
Diagnostické morfologické vyšetření odebraných buněk živých
pacientů (máme k dispozici pouze morfologii buněk, ne tkáně)
TYPY CYTOLOGICKÉHO VYŠETŘENÍ:
Punkční cytologie
- ložiskové léze
- výpotky
Exfoliativní cytologie
- stěry, otisky, sekret
Punkční jehlová biopsie
„core needle biopsy“
1 mm
DEFINICE:
Diagnostické morfologické
vyšetření malého vzorku tkáně
(punkční váleček)
Z punkčních biopsií je možno získat:
DNA, RNA, proteiny pokud se odběr zpracuje přímo, pokud zpracujeme do
parafinu jsou omezené možnosti dalšího zpracování
Výhody: snadno se odebírá, lze opakovaně (před léčbou, v průběhu a po ní)
Omezení:
omezená morfologická korelace (=pokud zlyzujeme, nevíme co přesně máme)
množství materiálu je poměrně malé
Vyšetření chirurgického resekátu: zlatý důl
biobankéře
Orgán nebo orgánový
komplex zaslaný k
vyšetření
Často obsahuje hodně
zbytkového materiálu
Různé typy
normální
tkáně
Tkáň
prekancerózy
Nádor
Z operačních resekátů je možno získat:
Hluboce zamrazený nebo alternativně fixovaný materiál pro izolaci DNA, RNA i
proteinů. Většinou kromě nádoru i vzorky odpovídající (zdrojové) nenádorové tkáně,
případně „sekretom“.
Výhody:
Máme paralelní vzorky v parafínu (morfologická korelace)
Objem bývá dostatečný
Omezení:
Zdaleka ne všechny léze se operují (malobuněčný karcinom plic, pokročilý
karcinom prostaty
Nelze získat v průběhu léčby
Vyžaduje zvláštní úsilí personálu
Problém s logistikou nativního vzorku (degradace RNA během 30-60 minut
teplé ischemie)
Co se s materiálem děje na patologii?
Makroskopický popis orientace, dokumentace a „přikrojení“
odběr na speciální metody, např. genetické
pokud je redundantní materiál, odběr do banky
Dokončení fixace, dokončení přikrojení po fixaci
Tzv. parafinový proces (voda nahrazena parafinem)
Řezání: 4-6 mikrometrů silné řezy
Barvení různými metodami
Diagnostika
Uzavření záznamu, kódování
Indikace dodatečného genetického testování (ras, B*raf, C-kit ..)
Banky biologického materiálu
Více např.: http://www.isber.org http://www.bbmri.eu
Přehled zpracování a uložení materiálu
Primární materiál Skladování
Zmrazená alikvoty tkáně Mrazák-80°C nebo tekutý dusík
Alikvoty tkáně v RNAlater Mrazák -20°C
Sérum/plazma krátkodobé Mrazák -20°C /-80°C
Sérum/plazma dlouhodobé Tekutý dusík
Parafinové bloky Normální podmínky
Sekundární materiál
RNA / DNA izoláty Mrazák -20°C /-80°C
Tkáňové lyzáty Mrazák -80°C
Legislativní aspekty
Česká republika je členem „: Úmluvy o lidských právech a
biomedicíně. “
Novela zákona 20 z roku 1966 o Zdraví lidu platná od 1.1.2008
Paragraf 26:
Lidskou tkáň je pro účely vědy a výzkumu možno použít „pouze
pokud byla pacientovi o možnosti jejího uchování a použití pro
lékařské potřeby podána ošetřujícím lékařem informace a pacient
s tím vyslovil prokazatelný písemný souhlas; součástí souhlasu
je vymezení účelu použití částí těla pacienta“.
Použití materiálu z biobanky pro výzkum schvaluje lokální etická
komise. Výběr z banky může rovněž podléhat schválení vědecké
komise (hodnotí adekvátnost a potenciál projektu).
Používáme „otevřený“ souhlas („broad consent“) tj. nespecifikuje se
projekt. Pokud by to mělo být jinak, máme problém
Výdej materiálu
 Na základě projektu studie schváleného lokální etickou komisí
 Posouzení vědecké hodnoty radou banky
 Na vzorky není právní nárok
 Výdej bývá bezúplatný, lze zpoplatnit práci a materiál ohledně archivace a výdeje
 Některé banky a sítě bank mají webové katalogy
 Je nutno „vytvořit sestavu“
+ Perfektně morfologicky charakterizovaný
Lze snadno mikrodisekovat v případě potřeby
Umožňuje perfektní lokalizaci na cílové struktuře pro
imunohistochemii a hybridizaci in-situ
Každá patologie ho archivuje, možno vytvořit velké sestavy
- Zatížen artefakty zpracování, tj.:
izolace a amplifikace DNA : omezeně
izolace a amplifikace RNA: velmi omezeně
izolace a blotting proteinů: prakticky nemožné
Parafinový materiál
„FFPE“
Speciální techniky biopsie
Speciální histologie:
 Histochemie
 Imunohistologie
 El. mikroskopie
 Obrazová analýza
Molekulární metodiky:
 ISH - hybridizace in
situ (FISH)
 PCR in situ - PCR v
histologických řezech
 CGH (komparativní
genomová hybridizace
Chromogen
Sekundární protilátka
Primární protilátka
Antigen
Princip imunohistochemie
Snadné vyhledání specifických buněk
Histogeneze a typizace nádorů
Prognostické parametry
Predikce odpovědi nádoru na léčbu
Exprese biomarkerů ve vazbě na specifickou strukturu
Koexprese biomarkerů
K čemu je to dobré
Imunohistologie - melanA
Snadné vyhledání specifických buněk
Heterogenita nádoru a metastazující klon -
Her-2
Primum Metastáza
Klonální evoluce - paralelní barvení Her-2/neu a
estrogenového receptoru v ca prsu (oba hnědá)
Ojedinělé buňky oba + Divergence klonů Klony samostatně
Steroidní receptory
V infiltrátu lze analyzovat jednotlivé
buněčné populace
CD20+ B lymfocyty CD3+ T lymfocyty CD68+
makrofágy
i některou subpopulaci, zde T buňky
CD4+ CD8+ CD45RO+
Vícekanalová imunofluorescence k detekci
buněčných populací
R. Lloyd: firemní prezentace Perkin-Elmer
Metody mohou být vysoce sofistikované
(vícekanálové barvení, obrazová analýza)
R. Lloyd: firemní prezentace Perkin-Elmer
Lze mapovat i prostorové vztahy
R. Lloyd: firemní prezentace Perkin-Elmer
Lze mapovat i prostorové vztahy
R. Lloyd: firemní prezentace Perkin-Elmer
 Sonda (próba) - krátký úsek DNA
komplementární ke hledané
sekvenci, předem označený.
Hybridizace in-situ
 FISH - fluorescenční in situ hybridizace
 sonda označena fluorochromem
 pozorování ve fluorescenčním mikroskopu
 vyšší rozlišovací schopnost
 možno použít několik sond současně
 specifické sondy proti fúzním genům (bcr/abl..)
 sondy detekujicí přestavbu genu
FISH
Složené bloky (TMA, „tissue microarray“)
Imunohistologie - problémy
 Protilátka která blotuje nemusí být
použitelná pro IHC a naopak
 Falešná pozitivita, nespecifické
barvení
 Někdy obtížná interpretace
 Limitované možnosti
multiparametrické detekce
Imunohistologie - problémy
1:50 1:200 1:400
Imunohistologie - problémy
Imunohistologie - problémy
1:50 1:200
Imunohistologie - problémy
Laserová mikrodissekce
+ Méně zatížen artefakty zpracování:
izolace a amplifikace DNA : ano
izolace a amplifikace RNA: ano
izolace a blotting proteinů: ano
možná kontrola kvality měřením fragmentace RNA
- Horší morfologická charakterizace
Limitované možnosti TMA
Méně snadná mikrodisekce
Málo stabilní po rozmrazení
Zdroje tkání jsou omezené
Hluboce zmrazená tkáň
Doporučené použití vzorků
FFPE
Imunohistochemie
Hybridizace in-situ
Omezené genetické
studie zaměřené na
specifikované změny
(mutace, translokace,
fuze, metylace..)
Evaluační studie na
velkých sestavách
RNAlater
Aplikace používající
RNA bez přesné
morfologické
korelace
Hluboce zmrazený
Extenzivní genomové a
proteomické stude
Celogenomové
sekvenování,
komparativní
proteomika (SWAT)
Studie objevné
(discovery) fáze
Data spojená se vzorkem
Typ vzorku
Počet alikvotů
Označení
Lokalizace v úložišti
Jestli je volný nebo rezervovaný pro studii
…
…
Jestli je ještě dosažitený
 Zaslaný materiál
• co a odkud jest odebráno, způsob odběru, fixace
• označení vzorku (-ů)
 Pacient
• příznaky a jejich trvání
• relevantní výsledky provedených vyšetření (RTG,
biochemie, KO, endoskopie...)
• výsledky předchozích histologických vyšetření
• další závažné choroby
• neoadjuvantní léčba, pokud byla
• cílený dotaz
Data sdružená s materiálem – primární
klinické údaje
Adjuvantní léčba
Komplikace
Vývoj markerů
..
..
Pokud došlo k recidivě, kdy a kde
Aktuální stav: - remise
- stabilizované onemocnění
- progrese
- úmrtí
Data sdružená s materiálem – sekundární
klinické údaje
 Stručný a výstižný popis materiálu,
zaznamenány zvl. údaje pro pT pN
klasifikaci a pro posouzení resekčních
hranic.
 orgán, ložisko a jeho velikost (mm), vztah
k okrajům či okolním strukturám, další
změny...
 mízní uzliny, jejich počet, patologický
vzhled...
Patologie - makroskopický popis
 V nejjednodušších případech může chybět
 Popis patologických změn ve tkáních,
výsledky speciálních vyšetření
(imunohistochchemie...)
 Pro klinika „nezajímavé“, ale:
 má forenzní hodnotu
 jiný patolog umí podle popisu rekonstruovat
obraz a rozvést diff. dg. rozvahy (např.
duplicita nebo metastáza)
Mikroskopický nález
 Jasně formulované závěry ke všem
vyšetřeným tkáním (dle platných
klasifikací).
 V případě nejednoznačného nálezu
diferenciálně-diagnostická rozvaha.
 Doporučení dalšího diagnostického
postupu, nový odběr...).
Patologie - závěr
 Histologický typing
 Histologický grading
 Staging WHO – TNM klasifikace
 Resekční okraje
 Vaskulární invaze, cílové molekuly (SR, EGFR,
HER-2, C-KIT), imunitní odpověď, prognostické
znaky (p53, Ki 67 )
Jaké informace navíc obsahuje
„onkologický“ bioptický nález?
 Typ - názvosloví (WHO, ICD-O)
 Stadium – anatomický rozsah nádoru (TNM)
 Grade – morfologický odhad malignity nádoru
 Rating - prognostika a predikce účinku
specifické terapie
Sumarizace – co u nádorů stanovujeme
Standardní nomenklatura WHO (ICDO-3):
8500/33
Histologický typ
Morfologie
Např.
8890 spinocelulární
karcinom
9010 fibroadenom
…
Biologické chování
0 benigní
1 nejisté
2 in-situ
3 maligní
6 metastáza
Grade 1 až 3
Odhad „stupně malignity“, „diferenciace“
V praxi = konvenční morfologická kritéria, liší se podle lokalizace a
morfologie nádoru
 Karcinom prsu: tubulární formace, jaderná polymorfie, mitotická
aktivita
 Sarkomy měkkých tkání: podobnost výchozí buňce, nekrózy,
mitotická aktivita
 Folikulární lymfomy: zastoupení „větších buněk“
 Prostata: Gleason skóre
 …
Histologický grade
TNM a klinické stadium
T(umor) N(odi) Metastases
 Tumor: nejčastěji kombinace velikosti a
anatomického rozsahu
 Uzlinové metastázy: ano-ne, případně počet a
lokalizace
 Vzdálené metastázy
Bez prefixu: klinická, prefix p pooperační …
Klinické stadium: určité kombinace TNM,
římské číslice I-IV
Např. pT1 pN0 pM0 stadium I
pT1-2 pN1 pM0 stadium II
jakékoliv pT jakékoliv pN M1 stadium IV
Survival Plot
0 20406080100120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
4
3
2
1
STADIU
ICDO-T: C504 ICDO-M: 8500/31 TNM: pT1c pN0 R0
Strukturovaná data - příklad
Prs, zevní horní
kvadrant Karcinom
neurčeného
typu
Grade I
Velikost 11-20
mm Lymfatické
uzliny negativní
Resekční
okraje čisté
Další strukturovaná data:
Stav hormonálních receptorů
Proliferace
Stav onkogenu HER2
…
Prognóza = pravděpodobnost
bezpříznakového přežití po definovanou
dobu
příklad: klinické stadium nemoci (anatomický rozsah)
mutace K-ras (biologický, horší prognóza)
Predikce = pravděpodobnost příznivé
odpovědi na určitou léčebnou modalitu.
příklad: přítomnost estrogenového receptoru (odpověď
na antiestrogeny)
mutace K-ras (mutovaný neodpoví na anti-EGFR
cílenou léčbu)
Prognostické a prediktivní parametry
Prognóza, predikce odpovědi na cílenou
léčbu
Faktory ovlivňující indikaci „necílené“ léčby: prognostické
•Klinické stadium
•Histologický typ
•Histopatologický grade
Faktory ovlivňující indikaci „cílené“ léčby: prediktivní
Přítomnost cílových struktur:
•Hormonální receptory
•Tyrosinkinázy (např. rodina EGFR, c-kit)
•Přítomnost specifických mutací (např K-ras, B-raf V600, EGFR, c-
kit)
Biologické prediktory, rating
Survival Plot
020406080100120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
2
1
HER2
Survival Plot
020406080100120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
2
1
CD1
Survival Plot
020406080100120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
2
1
PR
Specifické pro některé nádory např.:
 Estrogenový receptor a Her-2 amplifikace u karcinomu prsu
 Mutace K-ras u karcinomu tlustého střeva
 …
Určují někdy i odpověď na specifickou (tzv. „biologickou nebo
cílenou“ léčbu
Jenže to není tak jednoduché
Prognostické a prediktivní parametry spolu navzájem korelují
Léčba může vše ovlivnit..
Survival Plot
0 20 40 60 80 100 120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
2
1
HER2
Survival Plot
0 20 40 60 80 100 120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
2
1
HER2
Bez chemoterapie S chemoterapií
K čemu je to dobré
 Indikace onkologické léčby
 Sledování epidemiologie nádorů a úspěšnosti léčby nebo
diagnostiky
 Výzkum, klinické studie
K čemu je to dobré
 Molekulární klasifikace nádorů
 „Cancer genome project“ http://icgc.org/
 Mapování drah a „druggable targets“The Cancer Genome Atlas
Network – Nature
K čemu je to dobré
 Proteinatlas http:/proteinatlas.org
Jak má vypadat sestava biologického
materiálu k výzkumnému použití
Epidemiologicky reprezentativní (průřezová,
„konsekutivní“) – k evaluaci jevu nebo biomarkeru
Nebo naopak velmi cílená (= uniformní ve všech
parametrech kromě sledovaného), k objevu nových
biomarkerů
Musí být k dispozici klinická data
Materiál musí být homogenně zpracovaný
Materiál musí být adekvátní k zamýšleným metodám
Musí být proveditelná (a provedena) kontrola kvality pro
použité metody
Příklad možného postupu
Diferenciální screening na malé sestavě které se liši ve
pokud možno jen v jednom zásadním parametru
(nádor x výchozí nenádorová tkáň, karcinom in situ x
invazivní, nádor s metastázami x bez nich, nádor
odpověděl na léčbu x neodpověděl). Ostatní
parametry musí být pokud možno srovnané !
Screening některou z „high througput“ metod
(genomická, proteomická..)
Pokud se najdou rozdíly evaluace na dostatečně velké
retrospektivní sestavě.
Pokud to vyjde, hledání jak nalezený „cíl“ ovlivnit
Pokud se najde lék, nutno ověřit
…
Může následovat
Ověření rozdílných proteinů na TMA, stovky pacientů
Mapování drah
Jdou dráhy ovlivnit ? Malé molekuly nebo protilátky ?
In vitro studie
In vivo studie – xenografty
Studie fáze I až III
Závěrem
Lidský biologický materiál má v onkologickém výzkumu
zásadní úlohu a je nenahraditelný
Data o průběhu onemocnění jsou jeho neoddílnou
součástí
Zatím se bohužel v ČR málo sbírá a archivuje
Nicméně se to už pomalu mění ..
Děkuji za pozornost !