Proteomické aplikace a
experimenty
v onkologickém výzkumu
Pavel Bouchal
Analýza genové exprese: mRNA nebo
protein?
Protein: „proteom“ (PROTEin complement expressed by a genOME)
• informace o skutečných efektorech buněčných procesů – (což není případ
mRNA)
• proteiny jsou oproti mRNA chemicky velmi heterogenní – různá
hydrofobicita aminokyselin – stanovení genové exprese na úrovni proteinu
je technicky složitější
mRNA: „transkriptom“
• hladiny mRNA neodpovídají plně hladinám proteinů (degradace mRNAčas,
splice varianty, posttranslační modifikace proteinů)
• stanovení genové exprese je snadnější ve srovnání s proteiny
C
H
NH2
R COOH
CH3
CH2CH
H3C
H3C
N
CH2
H
CH
OH
H3C
H2N CH2 CH2 CH2 CH2
CH3 S CH2 CH2
HOOC CH2 CH2
HS CH2
CH2HOOC
CH2HO
C CH2
O
CH2
H2N
C CH2
O
H2N
CH
H3C
H3C
CH2HO
CH2
C NHH2N
NH
CH2 CH2 CH2
NHN
CH2
CH2 CH2
CH2 CH
NH
COOH
Gly
Ala
Val
Leu
Ile
Trp
Phe
Tyr
Ser
Thr
Cys
Met
Asp
Glu
Asn
Gln
Lys
Arg
His
Pro
CH2HSe
SeCys
CH
CH2
H3C
H3C
PŘEHLED AMINOKYSELIN
Analýza genové exprese: metody k dispozici
mRNA metody
• nejprve přepis mRNA cDNA (reverzní transkriptáza)
• qRT-PCR – analýza exprese 1 genu – PCR amplifikace
• více genů: čipové metody (expresní čipy-i pro celý genom): na principu
hybridizace nebo se zahrnutím PCR (citlivější)
Proteinové metody
• Separace proteinů (elektroforéza, chromatografie) nebo peptidů-před MS
• Identifikace proteinů: hmotnostní spektrometrie (MS), nebo imunochemie -
protilátky
• Protilátky: proti konkrétnímu proteinu (variantě), velmi specifické (ale někdy
crossreaktivita!), velmi citlivé
• MS: kvantifikace i několika tisíc proteinů v 1 analýze, méně citlivé
Proteinové metody: rozlišení a citlivost
Rozlišení
Citlivost
• Jednotlivé proteiny v celobuněčném vzorku se liší až o 12 řádů
v rozsahu koncentrací
• Více koncentrované proteiny zákonitě překrývají ty méně
koncentrované
• Málo koncentrované proteiny jsou pod limitem detekce
Náznak řešení:
• Frakcionace biologických vzorků
• Odstranění nejkoncentrovanějších proteinů (např. albuminu a
dalších z krevní plasmy)
• Použití imunochemie namísto MS (+/-)
• Kvantifikace exprese na úrovni transkriptu (+/-)
Dynamický rozsah koncentrací
proteinů v proteomice
• Proteomické workflow
⇒z jakých přístupů můžeme vybírat?
• Experimenty v onkologickém výzkumu
Funkční studie
Protein-proteinové interakce
Strukturní charakterizace proteinů
Vyhledávání biomarkerů
Verifikace a validace biomarkerů
⇒jak sestavit svůj experiment a jaké přístupy zvolit?
• Statistická analýza a validace na dalších
biologických úrovních
⇒nejdůležitější poznámky ke statistice
⇒databáze použitelné při interpretaci výsledků
I. Nejpoužívanější proteomické
přístupy a jejich kombinace
• Dvourozměrná gelová elektroforéza (2-DE)
• Hmotnostní spektrometrie a její možnosti
• SELDI-TOF-MS
• SILAC-LC-MS
• iTRAQ-(2D)LC-MS/MS
• Cílená proteomika (SRM)
• Protilátkové arrays (cell arrays, tissue arays)
Klasické proteomické workflow
(2-DE-MS)
1. Rozměr 2-DE: isoelektrická fokusace
IPG-IEF =proužky s imobilizovaným pH gradientem) –
dobrá reprodukovatelnost, napětí až 10000 V,
současný standard, komerčně dostupné
• 2. Rozměr 2-DE: SDS-PAGE
• Ekvilibrace IPG proužků před SDS-PAGE: obalení
proteinů SDS , redukce (DTT) a alkylace
(jodacetamid)
• SDS-PAGE (malý i velký formát)
10 až 12 % (homogenní) Mr 15000-100000
8-16% (porozitní gradient) Mr 10000-150000
reprodukovatelnost!
Barvení gelů
Obrazová analýza
Identifikace proteinů hmotnostní spektrometrií
ů
2-D DIGE
(diferenční 2-D elektroforéza)
2-D proteinová mapa
Langen H. et al.: 2-DE map of human brain proteins. Electrophoresis 20, 907 (1999)
pI
Hmotnostní spektrometrie
Iontové zdroje:
MALDI (matrix-assisted
laser desorption-
ionization)
ESI (electrospray
ionization)
Analyzátory:
TOF (time-of-flight)
Q3 (trojitý kvadrupól)
IT (ion trap-iontová past)
Orbitrap
Kombinace analyzátorů >hybridní
systémy
Intenzita
m/z
MS spektrum
• Identifikace proteinů z gelu a roztoku:
Štěpení trypsinem na peptidy MS spektrum peptide mass
fingerprinting v MS módu
peptidy ve hmotnostním spektrometru lze dále fragmentovat
částečná sekvenace peptidů peptide mass fingerprinting v
MS/MS módu (přesnější identifikace)
identifikace proteinů na základě srovnání s databázemi
• Kvantifikace proteinů a peptidů:
kvantifikace proteinů: SELDI-TOF MS, MALDI imaging
kvantifikace peptidů v MS módu: SILAC, label-free kvantifikace
(LFQ)
kvantifikace peptidů v MS/MS módu: iTRAQ, SRM
Co umožňuje hmotnostní spektrometrie
MS versus MS/MS
• Surface – enhanced laser desorption-ionization timeof-flight
mass spectrometry
• Příprava vzorku: podobně jako pro 2-DE
• Surface=povrch čipu, na nějž se proteiny vážou na
základě chemické nebo biochemické interakce
SELDI–TOF MS
Cu2+
SELDI – TOF MS
SELDI TOF MS
spektrum
SELDI-TOF MS pracuje
pouze v MS módu,
detekuje celé
intaktní proteiny
Kvantifikace pomocí SELDI-TOF MS
Princip: Srovnání ploch píků mezi spektry - např. vzorky různých pacientů
Identifikace proteinů=problém!
kombinací separačních přístupů a externího MS/MS – zdlouhavá,
často se nedaří. Je třeba mít štěstí
II. Proteomické workflow LC-MS
• Návrh experimentu
• Extrakce proteinů/příprava vzorku
• Štěpení proteinů na peptidy
• Frakcionace
• LC-MS/MS analýza
• Analýza dat: Identifikace a kvantifikace proteinů
• Statistická analýza dat
Extrakce proteinů/příprava vzorku pro LC-MS
Mechanická homogenizace v lyzačních pufrech na různé
bázi:
Denaturant
• močovina 2-8 M
• SDS až 4% (CMC~0.5%)
• Rapigest
výhody a nevýhody?
Redukční činidlo
• dithiothreitol (DTT)
• tris(carboxyethyl)fosfin (TCEP)
Štěpení proteinů
• In-solution
• In-gel
• Filter aided sample preparation (FASP)
• Precipitace proteinů - optional
• Redukce S-S můstků
• Alkylace –SH skupin (jodacetamid, MMTS)
• Trypsin (C-strana Lys, Arg pokud nenásleduje Pro)
• Lys-C (C-strana Lys i když následuje Pro)
Frakcionace
Snížení komplexity u komplexních vzorků (buněčné a
tkáňové lyzáty, séra) pro necílené analýzy => zvýšení
pokrytí proteomu
Frakcionace proteinů
• SDS-PAGE (SEC), pak in-gel digest
Frakcionace peptidů
• SCX-strong cation exchange
• RP-reverzní fáze v alkalickém pH
• HILIC-hydrofilní chromatografie
Orthogonalita separace vůči následné LC-MS/MS analýze
(RP v kyselém pH)
Kvantifikace s použitím SILAC značení
SILAC=
Stable isotope labeling
by amino acids
in cell culture
Značené AK k dispozici:
Lys, Arg
Kvantifikace s použitím SILAC značení
treatedcontrol
iTRAQ = Isobaric tags for relative and absolute quantitation
Postup:
• Příprava vzorku (např. 0.1% SDS) – až 8 kvantitativně
srovnávaných vzorků v 1 analýze
• Redukce a alkylace
• Digesce trypsinem
• Značení (iTRAQ značky: 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121)
• Smíchání 8 značených digestů
• Frakcionace peptidů (SCX, RPalk., IPG, HILIC, …)
• Kvantifikace a identifikace proteinů (LC-MS/MS nebo MALDI-
MS/MS)
iTRAQ – (2D)LC-MS/MS
iTRAQ – (2D)LC-MS/MS
Mix
Off-line Sample Clean-up & Peptide Fractionation with SCX HPLC Column
On-line RP-LC-MS-MS Analysis of SCX Fractions
iTRAQ LABEL 115
Trypsin Digestion
Reduce /
Block Cysteines
Sample 1
iTRAQ LABEL 116
De-Salt & Filter SCX Fractions
Reduce /
Block Cysteines
Trypsin Digestion
iTRAQ LABEL 117
Reduce /
Block Cysteines
Trypsin Digestion
Sample 2 Sample 3
Schéma typického iTRAQ – 2DLC-MS/MS experimentu
(zde 3-plex, nyní je možný až 8-plex)
MS/MS spektrum peptidu
s iTRAQ reportérovými ionty
Cílená proteomika a
selected reaction monitoring (SRM)
SRM a cílená proteomika
• SRM=multiple reaction monitoring (=MRM=multiple
reaction monitoring)
• Metoda kvantifikace peptidů z vybraného proteinu na
základě tzv. přechodů (transitions)
• Metoda vysoce selektivní, citlivá, používaná v
analýze nízkomolekulárních látek
• Velký potenciál pro validaci výsledků z proteomických
studií jako „HMOTNOSTNĚ-SPEKTROMETRICKÝ
WESTERN BLOT“ – místo přípravy protilátky by mohl
stačit návrh „přechodu“ pomocí software
• Uvádí se postupně do praxe, vyžaduje vývoj metody
na konkrétní proteiny
LC-MS/MS analýza
(instrumentace v RECAMO)
• LC: RP v kyselém pH (formic acid (FA))
on-line spojena s MS
• MS/MS analýza:
Orbitrap ELITE (Thermo)
CID/HCD/ETD
TripleTOF 5600+ (ABSCIEX)
necílená i cílená kvantifikace, SWATH
Protilátkové arrays
Cell array Tissue array
(imunohistochemie)
Srovnání proteomických metod: Výhody
a nevýhody
(úkol pro studenty na přednášce k doplnění)
2-DE SELDI SILAC iTRAQ-(2D)LC-MS/MS SRM
+
-
• Proteomické workflow
⇒z jakých přístupů můžeme vybírat?
• Experimenty v onkologickém výzkumu
Funkční studie
Protein-proteinové interakce
Strukturní charakterizace proteinů
Vyhledávání biomarkerů
Verifikace a validace biomarkerů
⇒jak sestavit svůj experiment a jaké přístupy zvolit?
• Statistická analýza a validace na dalších
biologických úrovních
⇒nejdůležitější poznámky ke statistice
⇒databáze použitelné při interpretaci výsledků
III. Proteomické experimenty v
onkologickém výzkumu
• Funkční studie
• Protein-proteinové interakce
• Struktura proteinů a proteinových komplexů
• Vyhledávání biomarkerů
• Verifikace a validace biomarkerů
Návrh experimentu
• Volba vhodného materiálu – dáno typem experimentu
buněčné linie, xenografty, tkáňové lyzáty, archivní FFPE
materiál, mikrodisekované (LCM) buňky z něj, kostní
dřeň, sekretované proteiny, krevní sérum/plasma
• Volba kvantifikačního postupu
2-DE/SELDI/SILAC/iTRAQ/LFQ/SRM
• Design experimentu
Biologické replikáty
Analytické replikáty
Randomizace
Blocking
A. Funkční studie
• Buněčné linie, případně in vivo modely
• Umlčení exprese genu v buněčné linii přirozeně
produkující daný protein: siRNA, TALEN (vs. kontrola)
• Mutantní forma proteinu (vs. wild type)
• Navození exprese genu v buněčné linii přirozeně
neprodukující daný protein: (Stabilně) transfekovaná linie
• Funkční charakterizace na buněčné úrovni (např. rozdíly
v invazivitě, migraci, proliferaci, expresi markerových
proteinů signálních drah, ….)
• Proteomika jako systémově biologický nástroj může
pomoci odhalit globální molekulární odpověď na
(ne)přítomnost sledovaného proteinu a tedy souvislost
se změnami hladin dalších proteinů – funkčních
partnerů
• Sledujeme změny hladin všech detekovaných proteinů
• Návrh experimentu?
• Volba kvantifikačního přístupu?
• Extrakce proteinů/příprava vzorku
• Štěpení proteinů na peptidy
• Frakcionace?
• LC-MS/MS analýza
• Analýza dat: Identifikace a kvantifikace proteinů
• Statistická analýza dat?
Workflow: Funkční studie
B. Analýza protein-protein interakcí
Cross-linkery při identifikaci proteinprotein
interakčních partnerů
• Návrh experimentu?
• Volba kvantifikačního přístupu?
• Extrakce proteinů/příprava vzorku
• Štěpení proteinů na peptidy
• Frakcionace?
• LC-MS/MS analýza
• Analýza dat: Identifikace a kvantifikace proteinů
• Statistická analýza dat?
Workflow: analýza protein-protein
interakcí
C. Proteomika a strukturní charakterizace
proteinů
• Top-down approach (=analýza intaktních proteinů bez
štěpení proteázou, ETD fragmentace) (vs. bottom-up)
• H/D exchange – protein-protein interakce v čase
• Posttranslační modifikace (PTM) – fosforylace,
glykosylace, acetylace
– hladina proteinu vs. změna PTM!
• Značný klinický zájem
• Úspěšnost uplatnění v klinické praxi zatím malá – celá
řada důvodů
• „Biomarkerová krize“ 2008-9
• Poté posun v pokrytí proteomu díky masovějšímu
uplatnění analyzátoru Orbitrap
• Nutno věnovat zásadní pozornost
-správně položené klinické otázce
-výběru vzorků
-experimentálnímu designu
-kvalitě klinických vzorků
-statistické analýze
-verifikaci proteomických dat
D. Proteomika při vyhledávání
biomarkerů
Jaký biologický materiál analyzovat?
• Modelové systémy - buněčné linie
• Tkáně
• Buňky mikodisekované z tkání (LCM – laser captured
microdissection)
• Kostní dřeň – leukémie
• Plasma – sérum
Vzorky od pacientů - etická pravidla!!
?
Workflow: Vyhledávání biomarkerů
• Návrh experimentu?
• Volba kvantifikačního přístupu?
• Extrakce proteinů/příprava vzorku?
• Štěpení proteinů na peptidy
• Frakcionace?
• LC-MS/MS analýza
• Analýza dat: Identifikace a kvantifikace proteinů
• Statistická analýza dat?
Screeningové metody:
• 2-DE, SELDI-TOF MS, SILAC-LC-MS, iTRAQ-(2D)LC-MS/MS,
LFQ-MS
Validační metody na proteinové úrovni:
• western bloting, SRM
Validační metody na úrovni mRNA (???):
• qRT-PCR, (expresní čipy)
Validační metoda na proteinové úrovni – tkáňové řezy:
• Imunohistochemie !!
E. Verifikace a validace potenciálních
biomarkerů
Verifikace a validace potenciálních
biomarkerů
• kvantitativní vs. funkční verifikace
• Imunohistochemie (IHC)
• IHC vs. cílená proteomika
negativní pozitivní
Návrh SRM metod
-výběr detekovatelných proteotypických peptidů (na
základě vlastních naměřených dat nebo knihovny
spekter – např. SRM atlas)
-výběr vhodných produktových iontů
-testování na základě kvantitativních parametrů
Verifikace a validace potenciálních
biomarkerů pomocí cílené proteomiky
• Návrh experimentu? Training + validation sample set
• Volba kvantifikačního přístupu?
• Extrakce proteinů/příprava vzorku
• Štěpení proteinů na peptidy
• Frakcionace?
• LC-MS/MS analýza?
• Analýza dat: Identifikace a kvantifikace proteinů?
• Statistická analýza dat?
SRM lze využít rovněž v základním onkol. výzkumu pro kvantifikaci
proteinů jako alternativa western-blotů či ELISY
SRM se používá jako rutinní kvantifikační metoda malých molekul
Workflow: Verifikace a validace
potenciálních biomarkerů pomocí cílené
proteomiky
SWATH koncept v onkologickém
výzkumu
-myšlenka: digitální fingerprinty, z nichž je možné
extrahovat kvantitativní proteomická data
-digitized biobanking
IV. Statistika
• Při srovnání exprese nutnost paralelní analýzy
minimálně 3+3 replikátů (analytické vs. biologické
replikáty)
• Normalizace dat
• Kvantitativně vs. statisticky významný rozdíl: >2x vs.
p-hodnota (Student t-test, Mann-Whitney test);
• Korelační analýza – nutno přizpůsobit design studie
• Korekce na mnohonásobné testování (FDR-korekce)
• při srovnávání více než 2 vzorků vhodná konzultace
se statistikem – často nutnost aplikace pokročilých
statistických metod
• Analyzujeme-li vzorky pacientů, soubor musí být
dostatečně reprezentativní a klinicky (patologicky)
charakterizovaný – spolupráce s patologem, s lékaři
Heatmapa – korelační analýza
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
Další zdroje informací – reviews v
předních světových časopisech
+ Quantitative Proteomics by Mass Spectrometry. Methods in
Molecular Biology series, No.359, Sechi, S. (Ed.).
Humana Press 2007
Děkuji za pozornost