Genová terapie
Petr Müller
Masarykův onkologický ústav
Genová terapie
=terapie využívající vpravení exogénni DNA do buněk či tkání organismu za účelem opravy fenotypu (deficience či mutace genu, vrozené či
získané choroby)
•klonování •expresní systémy •transfekce eukaryotických buněk •genová terapie v praxi
V běžné laboratoři se používá řada užitečných technik a postupů, které byli vyvinuty pro zdokonalení genové terapie
Klonování = vytváření identické kopie
Klonování v biologii
'Klonování buněk
•selekce mutantů-klonovací kroužky
^seleKC^TyMaorru^^^^^^^^^^ • klonování kmenových buněk
Klonování organismů
^^^^vegeíaiivnnozm nožová ní- říz ková ní •Dartenoaenez^ •klonování zárodečných buněk •somatické klonování
Molecular cloning
RT-PCR PCR
Hybridizace
Modifikace y*
Ligace
Rekombinace
Výběr plasmidu
expresní organismus •bakterie •virus •eu kary ota
Selekce
bakterie: Ampicilin, Kanamycin,Spectinomycin,
Chloramphenicol, Doxyciclin, Rifampicin
eukarvota: Geneticin, Blasticidin, Zeocin, Puromycin...
Promotor
virový, inducibilní, tkáňově specifický
Struktura genu, mRNA
Vektory pro genovou terapii
•DNA
•lineární DNA •plasmidová DNA
• Viry
•Adenovirus
•Adeno associated virus_
•Retroviry=MMLV, HIV=Lentivirus •Herpesvirus
a
o o <-> o u u
n
o
G)
n
ů. Cl ů- ů- ů. Cl. Z  Z Z Z Z E Z
NIMM
O CM
"D
O >
Q.
(0 "D
C % O Q.
o
> O
c
o
CD
*
-r
■= -
f-
o
OJ
Enhancer
v.
Promotor
Bazální promotoři ^>
r—A_
X
mRNA
Snaha o uvedení genové terapie v praxi probíhá paralelně s výzkumem regulace genové exprese
Požadavky na dobrý vektor
Regulace genové exprese
•Správné začlenění do genomu •Dlouhodobá exprese •Tkáňově specifická exprese •Optimální dávka
•Export m RNA z jádra do cytoplasmy •Poločas rozpadu m RNA •Úspěšné zahájení translace
RNA pol II regulated micro RNAi
In vivo versus ex vivo
o o
Vysoká okamžitá exprese Distribuce ve všech tkáních
Imunitní odpověď Náhodné začlenění
Choroby potenciálně léčitelné genovou terapií
Chybějící sérové proteiny
Hemofilie-faktorVIII, IX Wilsonova choroba- Ceruloplasmin
Metabolické choroby
Deficience ornitin dekarboxylázy
Svalové dystrofie
Poruchy imunitního systému
SCID-ADA deficience, X=linked... Další choroby s Mendelovskou dědičností
Cystická fibróza
Malignity
Solidní nádory Leukémie, Lymfomy
Neurodegenerativní choroby
Alzheimer- agregace Tau Huntingtonova choroba Parkinsonova choroba
o £ 2 o
o c
c > d) o
N *ť
li
5 ;ö
Odstranění agregovaného proteinu
Virové vektory:
většinou neschopné replikace (crippled)
•Vysoká schopnost vniknout do buněk
•Možnost zacílení prostřednictvím povrchových receptoru
•Schopnost aktivně se začlenit do genomu
Lentivirus (HIV)
Reverzní transkriptáza
Tranzientní transfekce (lipofekce, elektroporace)
Produkcí
Neurony infikované rekombinantním VSV nesoucím gen pro GFP
Cytomegalovirus Woodchuck hepatitis virus Bakteriofág M13 SV40 HIV
Normal cell
No functional p53 Viral replication Cell destruction,
virus release, virus spread
Figure 1; Selective Effect ol ONYX-015 on p53-Delicient Cells—The adenovirus ONYX-015 is under development to treat (umors lacking p53 function. Hypothetically, cancer cells Jacking Junctional p53 would be sensitive to viral replication and subsequent cylopathic effects.
Transfekce samotné DNA
•Lipofekce •Elektroporace •Dendrimery •Polymery (PEG) •Gene gun
Elektroporace
The phenomenon of electroporatlon
Cell membrane before pulling
Cell membrane during pulsing
Cell membrgne ffltcr pulUnfl fcetl return* ta
Lipofekce
Ceil membrane
Proteoglycan    _ * Z
Lipoplex
Enciocytosis
Liposome
■I- Lipoptex
Endosome
Escape from endosom©
Nucleus
DNA
Endosome with lipid mixing
Endosomal maturation
^0
DNA fragmentation v
DNA
Lyse some
Li pop i ex-mediated transfection and endocytosis
Expert Reviews in Molecular Medicine©2003 Cambridge University Press
Dendrimery
/ C02Me          L               large excess (15-250:1) 1 *Nj-- %  ....... _ r^^CONHl
J MeOH HNOC^ |
<> NH, NH2
MeOH
M eo2G'
PAMAM (polyamidoamine)
Komplex DNA-dendrimer
Gene gun
Before
Scrasn
Shock wave
Helium ga?
Restraining membrane
Kapton disc
Uicroprojectiles Slopping scrasn
Tissue """^
After
^12
T SSJO
Etické aspekty
•Klonování zárodečných kmenových buněk a jejich použití pro genovou terapii •Definice nemoci, normality •Zneužití, doping