Protein engineering Změna primární struktury proteinu s cílem získat nový protein s požadovanými vlastnostmi Zvýšení odolnosti proteinů teplota pH osmotický tlak Zesílení interakce terapeutické protilátky Změna specificity interakci fosfospecifické protilátky Vytváření nových vlastnostní fluorescenční proteiny změna isotypu protilátek Změna enzymatické aktivity biodegradace Fůzní proteiny Editace genomu specifické nukleázy cílená změna design na základě znalosti struktury a vlastností mnohastupňový proces kombinace v obou přístupů náhodná změna in vitro evoluce Cílená změna modelování predikce Bodová mutageneze selekce <^ kombinace mutací empirický test (in vivo, ex vivo) PoPMuSiC V2.0 Prediction of Protein Mutant Stability Changes In vitro evoluce Heterogenní populace Genotyp Fenotyp Kom petice Selekce Podmínky nutné pro in vitro evoluci: •kompartmentace genotypu a fenotypu •heterogenita genotypu-mutace •schopnost amplifikace Design in vitro evoluce: požadavky na fenotyp i způsob selekce Způsoby kompartmentace genotypu a fenotypu Ribosomal display Emulsní systémy Phage display Exprese na povrchu bakterií In vitro transkripce translace GFP Green Fluorescent protein Cíl změny GFP •Vyšší intenzita •Změna vlnové délky •Možnost fůze s ostastními proteiny •Krátký nebo dlouhý poločas rozpadu •Rozpustnost •Monomer Fluorescence Resonance Energy Transfer Evoluce PCR enzymů Only improved varií rits survive trie seleclion. KAPA SYBR* DNA Polymerase ■.vfHR (!V[)k'í:d s[i«::i ileal ly for real-lime PGR and oyljpgrfgrms wild-type Taq. ■^"^^Hl1^" Hfl* Gane variants are compartmentalized and expressed in emulsion followed by high-throng hipul screening in the presence of selection pressure. Wild-type gene coding for Taq DNA Polymerase. Mutagenesis creates large 2 gene library of 1 * 10 e random variants. Phage display • Knihovny peptidů po produkci si zachovají kódující sekvence • Je nutné provést selekci na vašem cílovém proteinu „Phage display" • Exprese peptidů na povrchu • Obvykle se k expresi využívá gen 111 • 5 kopií Konstrukce peptidových knihoven S~\ /O) Provede se eluce navázaných fágů Selekční proces s Aplikuje se knihovna na cílový protein I 4111 Od myjí se všechny nenavázané fágy Příklad Mapování anti-p53 protilátky PAb 240 1/12/2011 Selekce PAb 240 vazebného peptidu z náhodné "phage display" peptidové knihovny "p53 sequence" "Phage library sequences" Selekce mdm2 vazebných peptidů z náhodné "phage display" peptidové knihovny "p53 sequence" "Phage library sequences" Shoda PLSQET FSDLWKLL PENNV \a~pr FMDYWEGL N | VQN FIDYWTQQ F TGPA FTHYNATF IDRAPT FRDHWFAL V PEPLAV FADYWETL Y PA FSRFWSDL SAGAR xxxPx FxDYWxxL xxxxx Hioloogic Year OKT3 1986 — HUM ReoRro® 1994 1995 — 1996 Rituxan* 1997 Zenapax* Remicade® 1997 1998 Enbrel® 1998 Herceptin* 1998 Si muled* 1998 1999 Mylotarg6 2000 Campath* 2001 Zevalin® 2002 Xolair® 2003 RapLiva® 2003 Amevive* 2003 Bcxsar® 2003 Humira® 2003 Erbitux® 2003 Avastin* 2004 Tysabri"21 2004 Actemra* 2005 Orcficia* 2005 Lucentis* 2006 Veclibix* 2006 S271K $3736K $3020K IS115K - IS90K S107K * >$S0M in 2006 111 i i 111 i i 111 11 111 i i 111 i i 111 i 11 | i *0.5B fcl.OB SL5I1 S2.0U S2.5B fc3.0B $3,5B 2004 Sales S4,ttB I I Fc fusion protein I I I- -I l . i i-.h'i Mab I I Humanized Mab I Chimeric Mab I I Murine Mab H H H a 1 I I I f If all (unlikely) current Phase Ill candidal were lo be approved in ncstt 3-^1 years (I OtKt- POS 3 75% POS (industry average) would yield appro* ca. 55 marketed Mate and Fc fusion proteins If --50% of current Phase III candidates are approved in next 3—4 years (50% POS) I f al I current BLAs are approved and result in marketed biologies Current status as of July 20QE i ii i r 2404 Year (Current status) F^unm^u» i Fiq. 7-34- Dkiqram fff ImnHjrwqtobuJin G Tq& 3- wv< IW^I mo ian reziva J 3 33 Fab F (ab1) Fab' scFv di-scFv sdAb (fragment antigen briding) * (single-chain (single domain variable fragment) antibody) GeirrHine V-gcne segments Gene assembly in vitro Human B-cells from ns'i've or Immune donors VH(orVHCHI) VL|orVLCL) Ge/re ^ssemW/ entf 1 f ctoning or Stepwise cioning Immune, Naive of Synthetic Antibody Library of Human Fab fragments tntrnducg into E.voli ZincFinger nucleases TALE nucleases dHax3 Repeat domains 1.-*" 1213 ....... 34 LTPEQVVAIASfcLJG GKQALETVQRLLPVLCQ AH G 01 2 3 4 S £ 7 8 9 10 11 11. S ' Hax3 Nl HD Nl HD HD HD NS NS NS HD Nl NG Hax3-box TACACCC AAA CA T 01 234 5 6789 10 11 11.5