C7188 Úvod do molekulární medicíny 1/12 Definice Historie Obsah kurzu doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. Masarykův onkologický ústav Lékařská fakulta Masarykovy univerzity CEITEC © Ondřej Slabý, 2011 logo_MOU GS011558 Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 2 © Ondřej Slabý, 2011 Vymezení pojmu MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA [1] Massoud TF, Gambhir SS, Trends in Molecular Medicine, 2007 MOLECULAR MEDICINE is a branch of medicine that develops ways to diagnose and treat disease by understanding the way genes, proteins, and other cellular molecules work. Molecular medicine is based on research that shows how certain genes, molecules, and cellular functions may become abnormal in diseases such as cancer. according to National Cancer Institute (NCI) Molekulární medicína je obor založený na aplikaci poznatků a metod molekulární biologie do klinické medicíny vedoucí k cílené prevenci a vyššímu stupni integrace diagnózy a terapie. Molekulární medicína je širší pojem, nesprávně synonymicky používané pojmy: ~ Personalizovaná medicína ~ individualizovaná medicína ~ „adresná“ medicína ~ Translační medicína („from bench to bedside“) Zahrnuje obory jako farmakogenetika/genomika, nutrigenetika/genomika, ale také mikrobiologickou DNA diagnostiku, prenatální diagnostiku,... Koncepce a hlavní náplň oboru MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA 1)Identifikace individuálních genetických dispozic ke konkrétním chorobám a formulace preventivních opatření (molekulární epidemiologie, např. nutrigenomika) 2)Aplikace molekulárně-biologických metod do klinické diagnostiky (mikrobiologická DNA diagnostika, prenatální diagnostika,...) 3)Zdokonalení diagnostiky a přesnější formulace nozologických jednotek zohledňující jejich molekulární patologii 4)Identifikace nových terapeutických cílů (molekulárních struktur buňky) co nejvíce specifických pro dané onemocnění 5)Příprava léčiv nové generace (21st century therapeutics, cílená léčba, buněčná terapie, genová terapie,...) 6)Individualizace léčby na základě genetického pozadí jedince 7)Zdokonalení a zrychlení transferu technologií z laboratoří k lůžku pacienta (from bench to bedside) 8)Bioetika a právo Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 3 C:\___allimages\medicineelsi\ATCG_people.jpg INTEGRACE DIAGNÓZY A TERAPIE!!! © Ondřej Slabý, 2009 1)Kardiologie – SNP eNOS, apoB, LDLreceptor, MTHFR, ACE, plazminogen, inhibitor aktivatoru plazminogenu, ... psychiatrie zavislosti-DDR2, CCR5 HIV vstup do bunky spolecne s CD4 – mutace vede ke vzniku defektniho proteinu,BRCA1, BRCA2 – karcinom prsu, ovaria, RB1-retinoblastom, TP53=LiFramen, MLH1, MSH2, PMS1, MEN1, VHL-karcinom ledvin,atd. GENSCAN GHC a jine, nutrigenomika – individualizovany jidelicek,... 2)Priklad karcinomu prsu basal like, luminal likeA-C,Her2, breast like, klasifikace velkobunecneho Blymfomu, hypertenze,... ACE inhibitory 3 a 4) Terapeuticke cile – EGFR 5) KRAS, DPD, UGT – UDP glukuronosyl transferase, warfarin - CYP2C9 erbitux kolorektalni karcinom Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 4 © Ondřej Slabý, 2009 Pacienti neodpovídající na léčbu nebo vykazující závažnou toxicitu Pacienti se stejnou diagnózou Pacienti odpovídající na léčbu bez znaků závažné toxicity INTEGRACE DIAGNÓZY A TERAPIE Dogma JEDNA NEMOC=JEDNA LÉČBA Zrušení dogmatu JEDNA NEMOC=JEDNA LÉČBA Nosologická jednotka je dnes definována jako konkrétní příčina, která vede k rozvoji typického souboru příznaků. Tato „konkrétní“ příčina ovšem v naprosté většině případů není definována na molekulární úrovni. Neexistují dva naprosto stejné případy téže nemoci Jen velmi malá část lidských nemocí má jednoduchou, dokonce jedinou příčinu (některé dědičné nemoci a závažné infekce) I zde - hemofilie, tuberkulóza a AIDS kolísají individuální příznaky tak značně, že je nutné hovořit pouze o celkovém klinickém obrazu 1. Genetické dispozice ovlivňují průběh téměř všech nemocí 2. Mohou existovat rozdílné molekulární podtypy v rámci jedné diagnózy Příklad molekulární klasifikace karcinomu prsu Existuje pět molekulárních podtypů karcinomu prsu Sorlie et al, PNAS, 2001 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 5 Úvod do molekulární medicíny 1/12 Zrušení dogmatu JEDNA NEMOC=JEDNA LÉČBA Nejsou dvě léčby stejné = účinky jednoho léčiva se liší v závislosti na genetickém pozadí jedince = farmakogenetika, farmakagenomika Volba správné terapie nikoliv pouze na základě diagnózy, ale také vzhlededem ke schopnosti organismu nakládat s příslušnou látkou (vliv genetiky, vliv prostředí – interakce složek potravy) Farmakokinetika – např. metabolická schopnost organismu (CYP2D6, DPD) → toxicita, rezistence Farmakodynamika – přítomnost molekulárních změn → rezistence Předpoklad farmakogenetiky a farmakogenomiky: Genetické změny (prediktivní markery) spojené s fenotypy toxicity a rezistence jsou předem identifikovatelné. © Ondřej Slabý, 2009 Strana 6 Úvod do molekulární medicíny 1/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 6 Cíl tzv. precizní medicíny (precision medicine) Molekulární epidemiologie Molekulární patologie Molekulární diagnostika Molekulární farmakologie výzkum MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA aplikace aplikace výzkum Cílená prevence, integrace diagnózy a terapie Úvod do molekulární medicíny 1/12 © Ondřej Slabý, 2011 Strana 2 bruegel-elder_tower_babel_1 molekulární biolog lékař Pouze ilustrace Myšleno pouze jako stavba, nikoliv EU parlament! Úvod do molekulární medicíny 1/12 INTEGRACE DIAGNÓZY A TERAPIE!!! © Ondřej Slabý, 2009 Strana 7 Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 8 © Ondřej Slabý, 2009 Proč je investováno tolik financí do výzkumu a vývoje v oblasti MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNY? „If it were not for the great variability among individuals, Medicine might be a Science not an Art“ Sir William Osler, The Principles and Practice of Medicine, 1892 Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 20 © Ondřej Slabý, 2009 smile009.gif image by pure100 Úvod do molekulární medicíny 1/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 9 Historie molekulární medicíny – „počátky“ 1715 Giovanni Battista Morgagni, 1858 Rudolf Virchow 1859 Charles Darwin, 1865 Gregor Mendel, 1910 Thomas Hunt Morgan, 1944 Barbara McClintok 1949 – Linus Pauling – pojem Molekulární onem. 1953 – James D. Watson a Francis Crick – sekundární struktura DNA Nobelova cena – 1962 1957 – Francis Crick a George Gamov CENTRÁLNI DOGMA molekulární biologie Asi nejslavnejsim ranym patologem byl Morgagni lokalizoval nemoci do organu zakladatel patologicke anatomie, Německy patolog Virchow – tkane, bunky mikroskopicka anatomie •vzniku druhů přírodním výběrem, O pohlavnim vyberu •První ucelenou evoluční teorii vytvořil Jean Baptiste Lamarck (viz lamarckismus), ale dnešní vědci vycházejí spíše z teorie, kterou později předložil Charles Darwin (viz darwinismus, neodarwinismus), který spojil myšlenku postupné evoluce druhu s přírozeným výběrem, jakožto příčinou a hybnou silou evoluce. Kromě evoluce biologické se uplat'nuje i evoluce kulturní. Neodarwinismus je souhrnné označení pro současné hlavní paradigma evoluční teorie vzešlé z Darwinova učení. Zahrnuje zejménaNovou syntézu, tj. dřívější spojení darwinismu, Mendelovy genetické teorie a populační genetiky,genocentrický pohled na evoluci, jak byl popsán v pracích George C. Williamse a zpopularizován a rozveden v knihách Richarda Dawkinse (viz sobecký gen) aširoký adaptacionismus, přesvědčení, že hlavním motorem vývoje organismů je neustálé přizpůsobování se podnětům prostředí a že naprostou většinu znaků současných organismů lze vysvětlit nějakou dřívější adaptací. •olekulární podstata některých biologických systémů, jako jsou krevní srážení, imunitní systém, vidění apod., je velmi složitá a Behe se domnívá, že tyto systémy jsou neredukovatelně komplexní (irreducibly complex). Neredukovatelně komplexní je ten systém, který je tvořen několika dobře propojenými, vzájemně interagujícími částmi, jež přispívají k základní funkci tohoto systému, přičemž odstranění kterékoli části vede ke ztrátě funkce systému. Behe uvádí, že Darwin ve své knize „O vzniku druhů“ říká:Jestliže by mohla být demonstrována existence komplexního orgánu, u nějž by nebylo možné, aby vznikl díky četným následným malým modifikacím, moje teorie by se zhroutila. (Přeložil E. P.)Když Darwin asi před 150 lety navrhoval svoji teorii, nemohl znát molekulární podstatu života. Živé organizmy se jevily jako poměrně jednoduché systémy a z hlediska našeho současného poznání můžeme říci, že pro Darwina představovaly „černé skříňky“, do jejichž podstaty nemohl nahlédnout. Behe se trpělivě snaží čtenáři vysvětlit, že některé biologické systémy jsou na molekulární úrovni neredukovatelně komplexní. •V roce 1933 dostal Nobelovu cenu za lékařství a fyziologii za objevy role chromozomů v dědičnosti. Věren svému šlechetnému duchu, podělil se s odměnou za cenu se svými kolegy Sturtevantem a Bridgesem.Morgan se svými spolupracovníky odvodili z rozsáhlých pokusů s křížením drozofil, že geny jsou umístěny na chromozomech, a to v lineárním pořadí a že geny umístěné na stejném chromozomu tvoří jednu vazbovou skupinu. •Barbara McClintock (16. června 1902, Hartford, Connecticut – 2. září 1992, Huntington, New York) byla americká novátorská vědkyně a světově uznávaná cytogenetička. Zavedla například pojem skákající gen (genetická informace je pohyblivá). Za tento objev obdržela v roce 1983 Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství. Byla také oceňena Wolfovou cenou za lékařství. 1966 – Marshall Nirenberg, Heinrich Mathaei a Severo Ochoa rozluštili genetický kód Nobelova cena 1968 Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 10 © Ondřej Slabý, 2009 1970 David Baltimore izoloval enzym reverzní transkriptázu z RNA retroviru 1972 Paul Berg vytvořil první rekombinantní molekulu DNA 1974 Paul Berg navrhuje v Science dobrovolné moratorium na techniky rekominantní DNA 1974 Frederick Sanger zavedl metodu sekvenace DNA 1976 První biotechnologická společnost založená v Kalifornii GENENTECH, Inc – první lék připravený in vitro pomocí genového inženýrství – lidský inzulin uvedený na trh 1982 Paul Berg 1978 David Botstein zavedl metodu polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphisms-RFLP) Zásadní metoda pro identifikaci jednonukleotidových polymorfizmů (SNPs) Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 11 © Ondřej Slabý, 2009 EcoR1 – GAATTC Restrikční endonukleázy 1983 Kary Mullis v Cetus Corporation zavedl polymerázovou řetězovou reakci (PCR) Karry Mullis s hvězdou seriálu CSI: Las Vegas Marg Helgenberger The PCR Song There was a time when to amplify DNA, You had to grow tons and tons of tiny cells. Then along came a guy named Dr. Kary Mullis, Said you can amplify in vitro just as well. Just mix your template with a buffer and some primers, Nucleotides and polymerases, too. Denaturing, annealing, and extending. Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do. PCR, when you need to detect mutations. PCR, when you need to recombine. PCR, when you need to find out who the daddy is. PCR, when you need to solve a crime. (repeat chorus) Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 10 © Ondřej Slabý, 2009 Historie molekulární medicíny – moderní éra 1980s-2000s Strana 15 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 1/12 Geny a nádorová onemocnění Peyton Rous, Nobelova cena 1966 1910 Peyton Rous popsal význam viru v etiologii sarkomu kuřat Rous Sarcoma Virus (RSV) Počátkem osmdesátých let, byl klonován segment DNA z nádorové linie močového měchýře, který vykazoval schopnost indukovat neoplastickou transformaci v jiných buňkách =ONKOGEN J. Michael Bishop Harold E. Varmus Nobelova cena, 1989 Onkogeny jsou defektní formy proto-onkogenů (RSV) Nádorové supresory 2001- Nobelova cena L Hartwell, R Hunt, P Nurse regulátory buněčného cyklu Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 16 © Ondřej Slabý, 2009 Historie molekulární medicíny – moderní éra 1980s-2000s Mutační analýza Počátkem devadesátých let se objevují automatické sekvenátory (příliš nákladné) Nejpoužívanější jsou stále metody založené na PCR RFLP – polymorfizmus délky restrikčních fragmentů SSCP – polymorfizmus konformace jednořetězcové DNA DGGE – elektroforéza v gradientovém denaturačním gelu Na trhu se objevují komerční DNA kity – diagnostika Genová terapie 1987 – první rekombinantní DNA vakcína pro hepatitidě B, vytvořená inzercí segmentu virové DNA do kvasinkového vektoru 1990 – první podání genové terapie (retrovirové vektory s funkčním enzymem) u pacientky s ADA immunodeficiencí Klinická studie se SCID X1 imunodeficiencí u 14 dětí (u 2 došlo k rozvoji ALL) Vývoj nových virových i nevirových vektorů S. Altman a T. Cech – objev Ribozymů 1997 – Ian Wilmut – TVŮRCE DOLLY Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 17 © Ondřej Slabý, 2009 Somatická buňka dospělé ovce byla sloučena s neoplodněným enukleovaným oocytem jiné ovce Ovečka Dolly (1997-2004) Makak Neti a Ditto Autor Don Wolf, 1997 obr1.jpg Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 18 © Ondřej Slabý, 2009 Historie molekulární medicíny – moderní éra 1980s-2000s Polymorfizmy DNA Za geneticky polymorfní je považován znak s nejméně dvěma geneticky podmíněnými variantami v jedné populaci, které se nachází v takových frekvencích, že i zřídkavá má frekvenci alespoň 1%. Mezi lidmi je přibližně 99,9% shoda v sekvenci DNA Zbývajících 0,1% nás činí jedinečnými (jak vypadáme, nemoci, kterými budeme trpět, …) Bodové (single-nucleotide polymorphism SNP, vyslovuj snip) Frekvence přibližně jeden 1 SNP na 1kb DNA sekvence Repetitivních sekvencí (satelity, mikrosatelity – počty repetic) 1985 – DNA fingerprinting – komplexnost polymorfizmů satelitů umožňuje vytvořit unikátní DNA profil jedince 1987 – poprvé uznán DNA fingerprinting jako důkaz u soudu počátek forenzní molekulární biologie DNA polymorfizmy jsou genetickým pozadím souvisejícím mimo jiné také s dispozicemi k civilizačním chorobám a léčebnou odpovědí . Sir Alec Jeffreys 1998 – objev RNA INTERFERENCE Craig Mello a Andy Fire u C. Elegans –NOVÝ NÁSTROJ GENOVÉ TERAPIE Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 19 © Ondřej Slabý, 2009 mello_banquet2_photo Craig Mello na slavnostním banketu po udílení Nobelových cen za rok 2006. Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 21 © Ondřej Slabý, 2009 HUMAN GENOME PROJECT 1985-1990: diskuse o sekvenování lidského genomu – “nebezpečné” - “nesmyslné” - “nemožné” 1988-1990: Založen HUMAN GENOME PROJECT (HGP) 20 laboratoří z USA, Velké Británie, Japonska, Francie, Německa a Číny Asi 2800 lidí, vedoucí: Francis Collins, NIH Mezinárodní spolupráce: HUGO (Human Genome Organisation) Cíle: – genetická mapa lidského genomu – fyzická mapa: marker každých 100 kbp – sekvenování modelových organismů (E. coli, S. cerevisiae, C. elegans, Drosophila, myš) – objevit všechny lidské geny (předpokl. 60-80 tisíc) – sekvenování celého lidského genomu (3000 Mbp) do r. 2005 s rozpočtem 3 bil. USD Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 22 © Ondřej Slabý, 2009 Květen 1998 • Craig Venter zakládá soukromou biotechnologickou společnost CELERA GENOMICS, Inc. a vyhlašuje záměr sekvenovat celý lidský genom za 3 roky a 300 mil. USD metodou whole-genome shotgun, několik desítek zaměstnanců (sponzorováno Applied Biosystems) • V té době výsledek práce HGP: sekvenováno cca 4 % lidského genomu. Celera Genomics & akad. spolupracovníci publikují draft genomu Drosophila melanogaster (cca 2/3 z 180 Mbp) • ... whole-genome shotgun lze použít i pro velké genomy • ... Lidský genom: závod mezi Human Genome Project a Celera Genomics Únor 2001 - Remíza HGP publikuje draft lidského genomu v časopisu Nature 15.2.2001. Celera Genomics publikuje svou sekvenci lidského genomu v Science 16.2.2001. „Discovery can´t wait“ 20-CollinsVenter Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 23 © Ondřej Slabý, 2009 20-13-AltSeqStrategies-L Srovnání přístupu veřejného konsorcia a Celera Genomics Pracovníci veřejného konsorcia byli zavázáni tzv. Bahamskou deklarací, která stanovila, že se výsledky sekvenování musí do 24 hod. vystavit veřejně na internetu, aby všechna pracoviště mohla využít výsledků ostatních. Tato data ovšem využívali i pracovníci Celery, kteří ovšem nebyli Bahamskou deklarací vázáni a své výsledky nezveřejňovali. Clone-by-clone Whole-genome shotgun 20-11-ChromosomeWalking-L Craig Venter Září 2007, 10 mil. USD 32 million DNA fragmentů, 20 billionu bazí Total variants: 4.1 million 3.1 million SNPs 4000 genů mělo pozměněné proteinové produkty Venter netrpí CF ani Huntigtonovou chorobou James D. Watson Říjen 2007 Méně než 1 mil. USD Publikován v GeneBank Trvalo méně než 2 měsíce Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 24 © Ondřej Slabý, 2009 Následovaly sekvenační analýzy dalších jedinců z různých etnik, které přinesly podstatné informace o interpersonálních rozdílech ve struktuře genomů. Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 25 © Ondřej Slabý, 2009 Nové technologie založené na principu masivního paralelního sekvenování next-generation DNA sequencing technology Srpen 2009 Délka projektu: 8 týdnů 48 000 USD (Venter 10 MUSD -> HUGO: 3 000 MUSD) Roche 454 Genome/ Sequencer platfrom Solexa Ilumina SOLiD Applied Biosystems Paralelní sekvenování miliónů sekvencí, celkem 100 – 3000 Mb/run, jednotlivé sekvence dlouhé 20 – 400 bp Molekulární patologie nádorových onemocnění – buněčný cyklus, apoptóza, genetická nestabilita nádorů, rizikové faktory, angiogeneze, tvorba metastáz, mikroRNA, nádor jako komplexní tkáň, histopatologická klasifikace nádorů, mechanismus účinku vybraných léčiv, invazivita/chemorezistence – příklady kolorektálního karcinomu, mamárního karcinomu a glioblastomu Náplň příští přednášky Take home 1)Co je molekulární medicína? 2)Co znamená spojení „integrace diagnózy a terapie“? 3)Jaké jsou důvody a následky individualizace léčby? 4)Jaké milníky v historii molekulární biologie umožnily vznik oboru molekulární medicína a jaké nejnovější poznatky její rychlý vývoj v posledních letech? 1) 1) 1) Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 34 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 1/12 Doporučená literatura Strana 35 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 1/12 Strana 36 © Ondřej Slabý, 2009 Dotazy?