Nové trendy ve výzkumu mikroRNA Ondřej Slabý Masaryk Memorial Cancer Institute CEITEC, Masaryk University Molecular Oncology II – Solid Cancer Laboratory logo_MOU kódující geny představují méně než 2% celkové sekvence genomu vs. minimálně 90% lidského genomu je aktivně transkribováno čím více je organizmus komplexní, tím více obsahuje nekódujících RNA Svět nekódujících RNA Recent evidence suggests that the non-coding RNAs (ncRNAs) may play major biological roles in cellular development, physiology and pathologies. NcRNAs could be grouped into two major classes based on the transcript size: small ncRNAs and long ncRNAs. Sana et al, J Transl Med, 2012 Nové třídy nekódujících RNA HISTORIE 1993 Ambros, Ruvkun – objev miRNA lin-4 1998 Fire, Mello – popis RNA interference 1999 Tuschl, Zamore, Bartel, Sharp -RNAi 21-23 fragmenty 2000-2001 Hannon -Ago2, Dicer 2002 Zamore RNAi a miRNA sdílejí svoji efektorovou dráhu 2002 Croce, Calin miR-15,miR-16 u CLL 2004 Croce 50% miRNA genů na fragilních častech chromozomů 2006 Croce Deregulace miRNA v nádorové tkáni … 2007 První originální práce na téma miRNA v onkologii v ČR J Cell, 1993 Nature, 1998 PNAS, 2004 microRNA = 43832 microRNA and cancer = 19433 19.10.2015 23.29 Současnost ambros.JPG Victor Ambros 2012, CSHL © O. Slabý NEW! Definice mikroRNA MikroRNA je definována jako krátká, 21–23 nukleotidů dlouhá jednořetězcová RNA, která vzniká z dlouhého primárního transkriptu (pri-miRNA) a vlásenkové prekurzorové struktury (pre-miRNA) účinkem ribonukleáz v jádře a cytoplazmě a jejíž hlavní funkcí je post-transkripční regulace genové exprese. Kritéria: 1)krátká RNA musí být jednoznačně detekovatelná pomocí Northern blotu, RT-PCR nebo jiné standardní metody umožňující detekci RNA, 2)krátká RNA se musí vyskytovat v kmenové části vlásenkové, asi 70 nukleotidů dlouhé prekurzorové struktury, 3)sekvence krátké RNA a jejího prekurzoru musí být fylogeneticky konzervovaná (s výjimkou druhově specifických miRNA), 4)inhibice klíčových ribonukleáz v biogenezi miRNA musí vést k poklesu hladin krátké RNA a k akumulaci její prekurzorové struktury. Úvod do molekulární medicíny 4/12 Strana 29 © Ondřej Slabý, 2009 Základní fakta o mikroRNA •Přibližně 3% predikovaných lidských genů jsou geny pro miRNA •Jsou fylogeneticky vysoce konzervované •Geny pro miRNA jsou rozmístěny na všech lidských chromozomech s výjimkou Y •V databázi miRBase je anotováno 1390 mikroRNA*(1000 -2000 predikovaných) •Maturovaná miRNA je dlouhá 20-25 nukleotidů •MiRNA mají potenciál regulovat více než polovinu lidských kódujících genů •Jedna miRNA může regulovat desítky až stovky cílových mRNA •miRNA často tvoří rodiny nebo jsou kódovány v klastrech (eg. cluster miR-17) *Sanger miRBase release 17.0, 2011 Struktura a distribuce genů pro mikroRNA v lidském genomu •Geny pro miRNA jsou rozmístěny na všech lidských chromozomech s výjimkou chromozomu Y. •Přibližně 50 % miRNA se nachází v podobě klastrů (u člověka 55 klastrů), které jsou přepisovány jako polycistronní primární transkripty. Dle vztahu ke známým a definovaným transkripčním jednotkám dělíme na •Mezigenové miRNA (přibližně 50 %) •Intronové miRNA (přibližně 40 %) •miRtrony •Exonové miRNA Biogeneze a funkce mikroRNA 1.Transkripce miRNA genu 2. 2.pri-miRNA jsou zpracovány pomocí RNáz Drosha a Pasha 3. 3.pre-miRNA exportovány pomocí Exportinu 5 do cytoplazmy 4. 4.Zpracovaní pomocí RNázy Dicer 5. 5. Aktivní vlákno je inkorporováno do komplexu RISC 1. 6.Represe translace nebo degradace mRNA v závislosti na míře komplementarity Biogeneze a funkce mikroRNA microRNA: licensed to kill messenger Kanonický model biogeneze a funkce mikroRNA DESTABILIZACE mRNA!!! Pokles hladiny proteinových produktů cílových genů je ve více než 80% způsoben poklesem hladin mRNA v důsledku jejích destabilizace a nikoliv translační represí. (využití RPF) Guo, Bartel, Nature, 2010 DESTABILIZACE REPRESE REPRESE deadenylace NEW! Biologický poločas a rozpad mikroRNA Kai S, Nature Struct. Mol. Biol. 2010 MiRNA obecně představují vysoce stabilní molekuly, poločas miRNA v buněčných liniích nebo orgánech dosahuje mnoho hodin nebo dokonce i dnů! MiRNA mohou být regulované například blokováním jejich vazebných míst na mRNA pomocí RNA-vazebných proteinů. Volné miRNA jsou méně stabilní Koncept kompetujících endogenních RNA - ceRNAs Opačné vnímání regulačního mechanizmu miRNA → mRNA, kdy tzv. „competing endogenous RNA“ (ceRNA) regulují hladinu daného transkriptu tak, že soutěží o vazbu miRNA, která má schopnost daný transkript post-transkripčně regulovat. Všechny transkripty, které mají vazebná místa pro jednu miRNA, a tak možnost soutěžit její vazbu a vzájemně ko-regulovat svou expresi, potom vytvářejí komplexní síť (ceRNA network). Salmena, Pandolfi, Cell, 2011 Alemeida, Calin, Expert Opin. Biol. Ther., 2012 NEW! IzomiRs Neilsen, Trends in Genetics, 2012 •Poprvé popsány v roce 2008 na základě výsledků sekvenačních studií (Morin et al., 2008, Genome Res) •Jedna oblast kódující miRNA může vést ke vzniku mnoha rozdílných izomiRs. •Zastoupení jednotlivých izomiRs je tkáňově specifické a může se měnit v rámci odpovědi na různé biologické signály. •Vznik 5’ a 3’ izomiRs je podmíněn štěpením Droshou a Dicerem nebo účinkem transferáz. •Polymorfní izomiRs mohou vznikat v důsledku SNP (vzácné) nebo editací mikroRNA (A-I). Funkční dopady: specificita pro cílové mRNA, Ago loading, biologický poločas NEW! MikroRNA jako onkogeny nebo nádorové supresory MikroRNA jako onkogeny nebo nádorové supresory Lujambio, Nature 2012 Kong et al, Lancet Oncology 2012 Kasinsky, Slack, Nature Reviews Cancer, 2012 MikroRNA jako onkogeny nebo TS v závislosti na kontextu MikroRNA v patogenezi nádorových onemocnění MikroRNA jsou zapojeny do regulace všech šesti klasických a čtyř nových znaků maligního nádoru dle Weinberga a Hanahana. (Hallmarks of Cancer: The Next Generation, Cell, 2011) Slaby et al., Galen, 2012 MikroRNA v patogenezi nádorových onemocnění NEW! Slaby et al., Galen, 2012 MikroRNA jsou zapojeny do regulace klíčových signálních drah regulujících kmenové vlastnosti nádorových buněk. MikroRNA v patogenezi nádorových onemocnění NEW! Slaby et al., Galen, 2012 MikroRNA se podílejí na regulaci klíčových procesů autofagie, jako jsou signalizace mTOR, skládání komplexu ULK1, interaktom proteinu Beclin-1 nebo ATG4 signalizace. Milestones of circulating nucleic acid biomarkers Since 2008 more than 7000 citations Weber et al., Clin Chem, 2010 Cirkulující mikroRNA jsou přítomny ve dvanácti typech tělních tekutin Nair et al, Am J Epid, 2014 27.7.2015 1099 studies Number of publications focusing tissue/circulating microRNAs Survey of circulating microRNA study design (Jan 2012) Weiland et al, RNA Biology 2012 MAJORITY OF THE STUDIES SUFFER WITH LOW NUMBER OF SUBJECTS! NO INDEPENDENT VALIDATION! Biogenesis and mechanism of action of circulating microRNAs Schwarzenbach et al, Nat Rev Clin Oncol, 2014 Redova, Slaby, Future Oncology 2013 Biogenesis and mechanism of action of circulating microRNAs Falcone et al, JECCR, 2015 Tumor cell-derived exosomes to recipient cells Reports to demonstrate cell-cell transfer of extracellular miRNAs Turchinovich et al, Front Genet, 2013 Weber et al, Clinic Chem 2010, >375 citations MiroRNAs are present in 12 body fluids There are specific profiles of circulating microRNAs in cancer De Guire et al, Clinic Biochem, 2013 De Guire et al, Clinic Biochem, 2013 Circulating microRNAs are associated with wide range of pathologies Gilad et al., 2008 Stabilita cirkulujících mikroRNA Příčina stability cirkulujících mikroRNA Mlcochova et al., Urologic Oncology 2013 Pre-analytical variables affecting analysis of circulating microRNAs •Specimen collection and processing (collection tubes, additives (serum-clot activators, plasma-anticoagulants EDTA, heparin-heparinase), centrifugation, clotting time, time to processing,…) •Storage and stability Circulating microRNAs should be stable when stored at -20 and -80oC and for a short time at RT or 4oC There are conflicting data about the effect of freeze/thaw cycles •Blood cell count Different blood cell count significantly change the microRNA expression profile •Haemolysis miRNAs present in RBC could falsely elevate levels in haemolyzed samples •Platelet contamination MiRNA present in platelets could significantly contaminate serum profiles •Plasma volume/components optimal volume is necessary because due to presence of enzyme inhibitors •Pre-amplification of microRNAs •Other common preanalytical variables: gender, age, smoking, fasting, dietetic miRNAs Sérové mikroRNA jako diagnostické biomarkery u CRC Screen shot 2010-02-10 at 9.48.16 AM.png Screen shot 2010-02-10 at 9.49.22 AM.png Ng et al, GUT, 2009 89% senzitivita 70% specificita ALE….. miR-17-3p (P = 0,65) miR-29a (P = 0,27) miR-92a (P = 0,90) • miR-17-3p, miR-29a, miR-92a, miR-135b • endogenní kontrola: miR-16 • 100 pacientů, 30 zdravých dárců ČESKÁ REPUBLIKA Sérové mikroRNA jako diagnostické biomarkery u CRC Faltejskova et al, Cancer Biomarkers, 2012 Vliv hemolýzy na hladiny vybraných sérových mikroRNA Unpublished data, 2014 Vliv normalizace dat na hladiny sérových mikroRNA 30 zdravých dárců, 30 pacientů s CRC, 30 pacientů s RCC 9 genů/miRNA nejčastěji používaných k normalizaci exprese miRNA v tělních tekutinách: let-7a, miR-16, miR-93, miR-103, miR-106a, miR-191, miR-192, miR-223 and RNU43 Identifikace nejvíce vhodných referenčních genů užitím NormFinderu a GeneNormu Vliv normalizace dat na hladiny sérových mikroRNA Užití rozdílných přístupů k normalizaci exprese cirkulujících mikroRNA může vést ke zcela rozdílných výsledkům! P<0.001 Absolute quantification miR-16 as reference gene P<0.001 let-7a as reference gene CRC CRC CRC HC HC HC ZVÝŠENÁ HLADINA ZVÝŠENÁ HLADINA SNÍŽENÁ HLADINA Petra Faltejsková MiR-21 jako biomarker u kolorektálního karcinomu healthy donors CRC patients P < 0.0001 P = 0.0004 N=125 N=125 TNM STAGE Slaby et al, Oncology 2007 Faltejskova et al, Int J Colorectal Disease 2011 unpublished data 2014 Cirkukující sérové mikroRNA v diagnostice renálního karcinomu Vzorky krevního séra rozdělené do skupin na základě rozdílné exprese miRNA (žlutá barva znamená vzorky pacientů s renálním karcinomem, modrá pak vzorky kontrolních jedinců, vyhodnoceno metodou LIMMA, p<0001) Redova et al., J Transl Med 2012 Vzorky pacientů Vzorky kontrol é ê Škála hladin mikroRNA Robert Iliev Cirkukující sérové mikroRNA v diagnostice renálního karcinomu Fedorko, Int J Mol Sci, 2015 N=215 N=125 P<0.0001 P<0.0001 Sensitivity 80% Specificity 76% AUC=0,848 miR-378+miR-210 Močové mikroRNA jako diagnostické biomarkery uroteliálního karcinomu miR-21 (pelet vs supernatant).png čas odběru vzorku 1.png 4 zdraví dobrovolníci odběry 3x denně po dobu 5 dnů bioanalyzer.png Jarda Juráček Hanka Mlčochová unpublished data 2015 Močové mikroRNA jako diagnostické biomarkery uroteliálního karcinomu 59 miRNA P<0,01 unpublished data 2015 45 Močové mikroRNA jako biomakrery karcinomu močového měchýře N=47 miR-31 miR-93 Two examples of successful validation Second phase of validation, patent unpublished data 2015 Small RNA sequencing in blood serum of colorectal cancer patients Pooled samples Only spectrophotometrically evaluated non-heamolyzed samples were included 1 pool = blood serum of 12 patients (200ul serum, one pool=2,4 ml) •5 pools of healthy donors = 60 healthy donors •12 pools of CRC patients based on serum samples of 144 colorectal cancer patients (36 CRC patients of each clinical stage I-IV) RNA purification - miRNeasy Serum/plasma Kit (Qiagen) (glycogen as carrier) RNA yield 70-140 ng Illumina MiSeq, TruSeq Small RNA kit 2 pools in one sequencing run (7,5M per pool) http://www.ksre.ksu.edu/igenomics/fullsize1715.ashx miRNA/piRNA constructs Peak Size High Sensitivity DNA Bioanalyzer assay as checkpoint for correct size selection during library preparation TUMOR TISSUE BLOOD SERUM The proportions of annotated and non-annotated reads 34% vs 4% mature miRNAs More than 95% of all reads showed an average Q score >30. Percentage of mapped and annotated miRNA/piRNA reads compared to the total number of sequences 3,5% 32,7% 1,48% 5,67% 4 of 10 most abundant miRNAs in serum originated from RBC Ten most abundant microRNAs among all blood serum samples analyzed miR-92 in colon tissue miR-92 in blood serum of healthy donor isomiRs in circulation and tissue IsomiRs with additional bases are increased in blood serum !!! 20 miRNAs p<0.0001 MicroRNA differentialy expressed in blood serum of CRC patients and healthy donors 6 miRNAs with p<0.0001 MicroRNA differentialy expressed in serum of EARLY CRC patients and healthy donors 12 miRNAs with p<0.00001 MicroRNA differentialy expressed in serum of lymph node-negative and positive CRC cases 8 miRNAs with p<0.001 MicroRNA differentialy expressed in serum of CRC cases with and without distant metastasis CIRCULATING microRNAs as biomarkers in clinical trials MikroRNA jako tkáňové biomarkery spojené se známými histologickými a molekulárními podtypy nádorových onemocnění mikroRNA nepodléhají degradačním procesům během formalínové fixace a archivace v parafinových blocích jako je tomu u mRNA èARCHIVY FFPE MATERIÁLU NA PATOLOGIÍCH JE TAK MOŽNÉ VYUŽÍVAT PRO ROZSÁHLE RETROSPEKTIVNÍ STUDIE > > > versus mikroRNA z FFPE mRNA z FFPE Yaguang Xi, RNA, 2007, 13:1–7 > MikroRNA jako tkáňové biomarkery MikroRNA rozdílně vyjádřené v nádorové tkáni glioblastomu p<0.00001 Sana J, Carcinogenesis, 2014 Jiří Šána Andrej Bešše Prognostická sada 6-miRNA u pacientů s glioblastomem 9,8 měs. 4,4 měs. 7,8 měs. 7 měs. Sana et al, Carcinogenesis, 2014 Sana et al, Carcinogenesis, 2014 Prognostická sada 6-miRNA u pacientů s glioblastomem 16,2 měs. 7,5 měs. 16 měs. 12 měs. Replacement of miR-31 in GBM cells MikroRNA jako terapeutické cíle Wurdinger et al., Pharmacogenomics J, 2008 Iorio et al., EMBO Mol Med, 2012 Nádorově supresorová mikroRNA Substituční terapie MiR-215 jako nádorový supresor u kolorektálního karcinomu EP TT miR-215 N=240 párových vzorků (tumor vs. non-tumoral colon tissue) Faltejskova et al.,J Cell Mol Med 2012 Petra Faltejsková – – § § § § § § MiR-215 koreluje s klinickým stádiem a bezpříznakovým přežíváním u pacientů s CRC Low expression High expression Faltejskova et al.,J Cell Mol Med 2012 – – – – – § § § § § § P = 0.0168 P = 0.0122 P = 0.0273 Navýšení hladin miR-215 tlumí proliferací buněk odvozených od CRC Faltejskova et al.,J Cell Mol Med 2012 P < 0.001 P = 0.01 MiR-215 indukuje apoptózu a zástavu buněčného cyklu v G1 fázi P < 0.05 ↓ 50% MiR-215 snižuje migrační kapacitu nádorových buněk C:\Users\Petra Faltejsková\Documents\PGS\III. ročník\migrace\18.4.2014 DLD-1 poprvé 48h\mock 1.JPG C:\Users\Petra Faltejsková\Documents\PGS\III. ročník\migrace\18.4.2014 DLD-1 poprvé 48h\miR-215 4.JPG Jaké mRNA jsou pomocí miR-215 regulovány??? TYMS XIAP CD164 EREG HOXB9 PROLIFERATION APOPTOSIS CELL CYCLE MIGRATION ZEB2 * * * ** *** *** ** ** ** ** Jaké mRNA jsou pomocí miR-215 regulovány??? • • – – – – – § § § § § § • • – – – – – § § § § § § ** *** *** *** *** *** *** *** Jaké mRNA jsou pomocí miR-215 regulovány??? unpublished data 2015 MiR-215 ovlivňuje růst nádoru in vivo HCT-116+/+ (clone 33) HCT-116+/+ (clone 33) Jana Merhautová N=5 unpublished data 2015 MikroRNA jako terapeutické cíle Seznam mikroRNA které jsou testovány jako potenciální terapeutické cíle x MikroRNA ja ko terapeutické cíle Miravirsen, anti-miR-122 MikroRNA jako terapeutické cíle: from bench to bedside MRX34 – hepatocelulární karcinom a jaterní metastázy Masarykův onkologický ústav Doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. Prof. MUDr. Rostislav Vyzula, Ph.D., Prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. Doc. MUDr. Jan Doležel, Ph.D. MUDr. Radek Lakomý, Ph.D., MUDr. Alexandr Poprach, Ph.D., MUDr. Michal Staník, Ph.D., MUDr. Radim Němeček,.. FN Brno prof. MUDr. Zdeněk Kala, CSc., doc. MUDr. Leoš Křen, Ph.D., prof. MUDr. Dalibor Pacík, CSc., MUDr. Michal Fedorko, MUDr. Jan Hlavsa, Ph.D.,…. FNuSA Brno – prof. MUDr. Markéta Hermanová, Ph.D., doc. MUDr. Radim Jančálek, Ph.D. doc. RNDr. Ondřej Slabý, PhD postdocs Mgr. Martina Rédová, PhD doc. MUDr. Marek Svoboda, PhD doc. MUDr. Julie Bienertová-Vašků, PhD Nithyananda Thorenoor, PhD PhD studenti Mgr. Renata Héžová Mgr. Jiří Šána Mgr. Petra Faltejsková Mgr. Hana Mlčochová Mgr. Robert Iliev Mgr. Zbyněk Čech Mgr. Jana Merhautová Mgr. Andrej Bešše Mgr. Jitka Mlčochová Mgr. Jaroslav Juráček Pregraduální studenti Bc. Anna Čurdová Bc. Renata Kleinová Bc. Zdeňka Kosařová Bc. Soňa Klusová Bc. Zuzana Ožanová Poděkování CEITEC, Skupina Molekulární onkologie II logo_MOU