Stanovení genotypu a aktivity alkohol dehydrogenasy z krve



Xenobiotika (xenos = cizí)
•  normálně se v organismu nevyskytují
•  nejsou nutné pro jeho zdravý vývoj
•  neslouží pro organismus jako zdroj energie.
Primárním zdroje xenobiotik
•chemický průmysl (PAH, PCB, benzen, fenoly, ....)
•kouření (PAH, aromatické aminy, ….)
•jídlo a alkohol (PAH, arylaminy, heterocyklické a  aromatické aminy, .…)
•aflatoxiny

Xenobiotikum
Silně lipofilní
Lipofilní
Polární
Hydrofilní
1.Fáze biotransformace
  aktivace/inaktivace
oxidace, redukce, hydrolýza
2. Fáze biotransformace
  aktivace/inaktivace
konjugační reakce
Akumulace v tukové tkáni
Polární
Hydrofilní
Extracelulární tekutiny – exkrece játry, ledvinami

1. fáze biotransformace
•     zavedení polární funkční skupiny do molekuly lipofilní látky
       - OH, -NH2, -SH, = CO, - COOH
•reakce 1. fáze biotransformace: oxidace, redukce, hydrolýza
•během 1. fáze biotransformace může docházet jak ke snížení tak ke zvýšení toxicity
Nejčastější reakce je oxidace katalyzovaná:
Øcytochrom P - 450                         (CYP450)
Øalkoholdehydrogenáza                               (ADH)
Ømonoaminoxidázy a diaminoxidázy          (MAO)

Cytochrom P450
•    skupina membránově vázaných hemo-proteinů obsahujících atom Fe3+
•účastní se metabolizmu endogenních látek i xenobiotik
•nachází se především v hladkém endoplazmatickém retikulu jaterních buněk
•nespecifickým enzym
Schéma oxidace pomocí CYP450
+ O2 + NADPH + H+
+ H2O + NADP

•Hydroxylace alifatických a aromatických uhlovodíků
      (benzén a jeho deriváty, PAHs, aflatoxiny, alkany, PCB)
•     Epoxidace nenasycené dvojné vazby (styrén, vinylchlorid)
•     Hydroxylace aminů (anilin)
•      -O, -N a –S dealkylace
•     Dehalogenace (PCB, formaldehyd, dibenzodioxiny, dibenzofurany)
Oxidace katalyzované CYP450

CYP1A1
CYP1A2
CYP1B1
CYP3A4
CYP2C
2,3-epoxid
4,5-epoxid
9,10-epoxid
7,8-epoxid
Fenoly
4,5-diol
9,10-diol
7,8-diol
CYP1A1
CYP1A2
CYP1B1
7,8-diol-9,10-epoxid
Glutathion-konjugáty
GSTA1
GSTM1
GSTP1
DNA adukty
tpoison
1-OH
3-OH
6-OH
7-OH
9-OH
9-OH-4,5-oxid
9-OH-4,5-diol
DNA adukty
tpoison
B(a)P
EH
EH
CYP1A1
CYP1A2
CYP1B1
EH
Pokles aktivity má protektivní účinek
Pokles aktivity nese vyšší riziko

ethanol
ADH
(Alkohol dehydrogenáza)
NAD+
NADH + H+
NAD+
NADH + H+
ALDH
(Aldehyd dehydrogenáza)
CYP2E1
Kataláza
+ H2O2
- H2O
acetaldehyd
k. octová
Oxidace alkoholu katalyzovaná enzymy alkohol dehydrogenáza (ADH) a aldehyd dehydrogenáza (ALDH)

ADH1B (48 R/H)
Studie ukázaly, že jedinci nesoucí alelu 48 H/H mají silně zvýšenou aktivitu ADH.
ADH1C (349 F/I)
Studie ukázaly, že jedinci nesoucí alelu 350 I/I mají zvýšenou aktivitu ADH.
Zkoumané polymorfismy
Genotypy budou analyzovány pomocí PCR a restrikční analýzy
Restriktáza HhaI
rs1229984 - ADH1B*48His

rs1229984F: GGTGGCTGTAGGAATCTGGC
rs1229984R: TTGACTGTAGTCACCCCTTCT
Restriktáza SspI
rs698 - ADH1C*349Ile
rs698F: GGCTAAGAAGTTTTCACTGGA
rs698R: GCCGCTACTGTAGAATACAAAG

Měření aktivity
http://toxnet.nlm.nih.gov/png/138-89-6.png
p-nitrosodimethyl anilin   +   NADH -----------à  ????
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b7/Pyrazole_structure.png
Pyrazol – inhibitor reakce

Obvyklé konjugační reakce:
•  konjugace s k. glukuronovou
•  sulfátová konjugace
•  glycinová konjugace
•  acetylace
•  metylace
•  glutathionová konjugace
Obvyklé konjugační reakce:
•  konjugace s k. glukuronovou
•  sulfátová konjugace
•  glycinová konjugace
•  acetylace (N-acetyltransferáza)
•  metylace
•  glutathionová konjugace (Glutathion-S-transferáza)
2. fáze biotransformace
•Xenobiotikum se přes polární funkční skupinu navázanou v první fázi váže na vysokomolekulární
endogenní konjugační činidlo
•Konjugát má obvykle menší biologickou aktivitu,  vyšší rozpustnost ve vodě a vyšší molekulovou
hmotnost než původní látka (metabolit z 1. fáze)

Acetylace pomocí N-acetyltransferáz (NAT1 a NAT2)
•důležitá metabolická cesta pro látky obsahující aminoskupinu ve své  molekule
•  arylaminy, heterocyklické a  aromatické aminy, atd.

NAT
CYP1A2
CYP1A2
hydroxylamin
hydroxylacetylamin
Arylamin
N-acetamid
N-acetoxy-ester
N-acetyl-acetoxy-ester
tpoison tpoison
Nitréniový ion
DAC
NAT
DAC
OAT
NOAT
OAT

Konjugační reakce s glutathionem katalyzovaná Glutathion-S-transferázou (GST)
+ GSH
GST
•největší význam má membránově vázaná GST, protože se vyskytuje  v blízkosti CYP450
 =  Glutathion (GSH)
Glu                Cys              Gly