CG020 Genomika Přednáška 7 Sekvenace metodami příští generace Roman Hobza Laboratoř vývojové genetiky rostlin Biofyzikální ústav AVČR, Královopolská 135, CZ-621 65 Brno, Česká republika hobza@ibp.cz; http://www.evolucnigenomika.cz/ Sekvenování genomů GenBank vznikla v roce 1982 z Los Alamos Sequence Database Walter Goad Proč sekvenovat dál? • Komparativní genomika • Biomedicínský výzkum • Osobní genom Frederick Sanger 1958 – Nobelova cena za určení struktury inzulínu 1975 - Dideoxy sekvenační metoda 1977 – osekvenoval Φ-X174 (5,368 bp) 1980 – dostal druhou Nobelovu cenu za chemii Později (polovina 80-tých let) osekvenoval bakteriofága λ pomocí shotgun metody (48,502 bp) Sekvenování genomů • 1986 Leroy Hood: první automatický sekvenátor • 1986 Human Genome Initiative • 1990 započat projekt sekvenování lidského genomu (předpokládaná doba 15 let) Leroy Hood Sekvenování genomů • 1995 John Craig Venter sekvenoval první bakteriální genom • 1996 první eukaryotický genom (kvasinka) sekvenován John Craig Venter • 1997 sekvence E. coli • 1998 Caenorhabditis elegans genom (první multicelulární genom) • 1999 lidský chromozom 22 sekvenován Sekvenování genomů Sekvenování genomů • 2000 Drosophila melanogaster genom • 2001 Human Genome Sequencing: předběžná sekvence lidského genomu Sekvenování genomů • duben 2003 Lidský genom. Sekvence myšího genomu. • duben 2004 Sekvence krysího genomu 2010 Ideální lidský genom sekvenován 2010 Ideální lidský genom sekvenován The Race for the $1000 Genome. Science 311: 1544 – 1546, 2006 Honba za sekvencemi ØHuman genome (first draft) – $300 million (2001) ØRhesus macaque – $22 million (2006) Redukce kopmlexity Hi-Cot selection Redukce kopmlexity Methylation filtration (MF) E. coli McrBC (5mC restriction) Sheath fluid Deflection plates Excitation light Waste Right collector Left collector Laser Scattered light Fluorescence emission Relative fluorescence intensity Chromosomes in suspension Flow sorted chromosomes Flow karyotype Flow chamber Numberofevents Flow sorted chromosomes Redukce kopmlexity – třídění chromosomů Laserová mikrodisekce Výhody: vysoká čistota Nevýhody: malý počet chromozomů, pracnost Metody sekvenování • http://www.454.com Genome Sequencer 20 System 454 pyrosequencing (2005) DNA library preparation Fragmentace DNA Ligace adaptoru Vychytání DNA molekul denaturace emPCR Vznik emulze (olej) emPCR emPCR Vychytání kuliček Vychytání kuliček denaturace Sekvenační primer Disperze na sklíčko Disperze na sklíčko Parametry mikroreaktorů Parametry mikroreaktorů sekvenace sekvenace sekvenace sekvenace sekvenace sekvenace sekvenace sekvenace SOLID (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) 2-base encoding sequencing (2007) Solexa (2007) HELICOS (2008) True Single Molecule Sequencing (tSMS) Single Molecule Real-Time (SMRT) Pacific Biosciences 20 zeptolitrů Ion Torrent Oxford nanopore Další technologie • Mikroelektroforéza • Sekvenování na bázi microarray