12/12/2014 1 Molekulová luminiscence C7955 Petr Táborský Jan Preisler Ústav chemie, PřF MU, BRNO Doporučená literatura Knihy: A. Sharma, S. G. Schulman - Introduction to Fluorescence Spectroscopy J. R. Lakowicz - Principles of Fluorescence Spectroscopy B. Valeur - Molecular Fluorescence: Principles and Applications Časopisy: Journal of Fluorescence (http://www.springerlink.com/content/1573-4994/) Journal of Luminescence (http://www.sciencedirect.com/science/journal00222313) Luminescence-The Journal of Biological and Chemical Luminescence (www.interscience.wiley.com/journal/bio) Internet: http://www.fluorescence-foundation.org http://bart.chemi.muni.cz Světelné záření • světelný paprsek je charakterizován frekvencí (υ) oscilace magnetické a elektrické složky (kolikrát za sekundu je vektor složky v maximu), resp. vlnovou délkou (λ) • rychlost světla (c) ve vakuu je 3 x 108 m/s • pro rychlost světla platí: c = λ υ • elektricky nabitá částice (elektron) je schopna interakce se světelným vlněním (ovlivnění je dáno elektrickou složkou paprsku). • přijatá energie (E) je kvantována: E = h υ • h je Planckova konstanta (h = 6.625 x 10-27) 12/12/2014 2 Viditelné záření - světlo Spektrum Vlnění Snellův zákon • Snellův zákon patří k základním zákonům popisujícím šíření vlnění, které přechází (tzv. lomem) přes rozhraní z jednoho prostředí do jiného prostředí, kde se skokově mění optické vlastnosti prostředí. • Je důležitou součástí geometrické optiky, kde popisuje lom paprsku světla a obecněji elektromagnetického záření na rovinném rozhraní. • Nese jméno jednoho z objevitelů, nizozemského matematika W. van Snella • Ze Snellova zákona plyne, vyjádřeno slovy, že: • Při šíření záření z prostředí opticky řidšího do opticky hustšího prostředí se paprsky lámou směrem ke kolmici (tzv. lom ke kolmici). • Při šíření záření z prostředí opticky hustšího do opticky řidšího prostředí se paprsky lámou směrem od kolmice (tzv. lom od kolmice). • Opticky hustším, resp. řidším prostředím je míněno prostředí s vyšším, resp. nižším indexem lomu. 12/12/2014 3 Disperze světla • Při lomu světla dochází k tomu, že se rozkládá na jednotlivé vlnové délky. Příčinou toho je závislost rychlosti světla v látkách na frekvenci – disperze světla. Při normální disperzi se rychlost světla zmenšuje s frekvencí. Ve vakuu k disperzi nedochází. • Při průchodu rozhraním se nemění frekvence světla, mění se však rychlost světla a tím i vlnová délka. Teorie Barevnosti Fyzikální základy barevnosti Rozdílní interakce barviv jsou důsledkem pohlcení části záření (to tvoří proud fotonů, tj. kvant energie) o určité vlnové délce. Lidské oko je schopné vnímat záření o vlnové délce 400 až 760 nm. Záření o vlnové délcer pod 400 nm je ultrafialové záření (UV), záření nad 760 nm je infračervené (IČ). Záření v těchto oblastech nevyvolává zrakové vjem a je pro lidské oko neviditelné. Pokud je záření v celém intervalu viditelného světle, jeví se jako bílé. Záření o vlnových délkách v intervalu viditelného světla vyvolává zrakový dojem uvedený v tabulce. Je zde uvedena i barva doplňková, která se vytvoří smíšením nepohlceného světla. Pokud předmět pohltí z bílého záření, záření o určité vlnové délce, odráží se do oka zbývající část a oko má vjem doplňkové barvy. Vlnová d. [nm] Barva Doplňková 400 - 435 fialová zelenožlutá 435 - 480 modrá žlutá 480 - 490 zelenomodrá oranžová 490 - 500 modrozelená červená 500 - 560 zelená purpurová 560 - 580 zelenožlutá fialová 580 - 595 žlutá modrá 595 - 605 oranžová zelenomodrá 605 - 730 červená modrozelená 730 - 760 purpurová zelená V zelené škále rostliny rostou pomaleji nebo vůbec ne. V podstatě je zelená jediný typ světla, které rostlinné chloroplasty nevyužívají. To je také důvod, proč je to jediná barva odražená od listů (to je co vidíme). 12/12/2014 4 Molekulová elektronová struktura • orbitaly a elektrony v molekule, jenž jsou ovlivněny vazebnými interakcemi jsou zodpovědné za vznik elektronových spekter ve viditelné a ultrafialové oblasti spektra • platí Pauliho vylučovací princip • nejčastější metody výzkumu molekulové elektronové struktury jsou spektrofotometrie (absorbance) v oblasti UV-Vis, luminiscenční spektroskopie. Absorpce energie molekulou Příklad: molekula butadienu po absorpci energie ve formě fotonu Čtyři atomové (AO) p orbitaly Molekulové orbitaly (MO) v normálním stavu Excitovaný stav (po absorpci) Absorpce v=3 v=2 v=1 v=0 S0 S2 S1 T1 absorpce fosforescence přechod mezi systémy fluorescence Jablonského diagram vibrační relaxace S1 12/12/2014 5 převzato z www.biophysic.com (25.7. 2014) Zpožděná fluorescence T1 S1 S0 fluorescence zpožděná fluorescence fosforescence ΔE (teplo, srážky, atd.) absorpce Princip • jde o termální excitaci molekuly s nejnižší hladiny tripletového stavu zpět na nejnižší hladinu excitovaného singletového stavu (je to reverzibilní mezisystémový přechod (reverse intersystem crossing) mezi T1 a S1) • k fluorescenci dochází po návratu na S1 (proto je vlnová délka je stejná jako u „běžné“ fluorescence) • mezisystémový přechod způsobuje zdržení celého děje (čas vyhasínání je mnohem delší, než u „běžné“ fluorescence) Typy termální excitace • E-typ zpožděné fluorescence – probíhá u pevných vzorků a je doprovázen zahříváním systému, případně statistickou fluktuací elektronů mezi hladinami (jen pokud rozdíl mezi tripletovou hladinou a excitovaným singletem není příliš vysoký). Jedná se o jednofotonovou absorbci a závislost mezi intenzitou emise a intenzitou budícího záření je lineární. Poprvé byl tento jev pozorován u eosinu (E-typ). • P-typ zpožděné fluorescence – k excitaci dochází po kolizí dvou molekul v tripletovém stavu. Jedna molekula v tripletovém stavu odevzdá nezářivě svoji energii druhé molekule v tripletovém stavu a ta přejde do excitovaného singletu (triplet-triplet annihilation). Rozdíly mezi S1 a T1 mohou být vyšší, než u typu E. Je to dvoufotonová absorbce (excitace dvou molekul), proto je intenzita fluorescenční emise přímo úměrná čtverci intenzity budícího záření. Tento jev byl poprvé pozorován u pyrenu (P-typ). 12/12/2014 6 Vnitřní konverze Obecně jde o přechod mezi nejnižší excitovanou hladinou (S1) na nejvyšší vibrační hladinou nejnižší singletové hladiny (S0). a) vibrační hladiny S0 sahají až k vibračním hladinám S1. Elektron se tak může přejít mezi S1 a S0 bez toho, aby se výrazně změnila jeho energie. b) vibrační hladiny S0 a S1 jsou blízko sebe a za jistých okolností může elektron přejít díky tunelovému efektu. Pravděpodobnost tohoto děje se zvyšuje se zmenšením vzdáleností mezi hladinami. S1 S0 S1 S0 • molekuly mají v základním a v excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti (je to způsobeno elektrostatickými interakcemi s okolím molekuly – např. solvatací) • okamžitě po absorpci není excitovaná molekula v rovnovážném stavu a do rovnovážného stavu se dostane až dojde k vyrovnání sil, které na ní působí • doba potřebná pro molekulární relaxace je mnohem delší, než je rychlost elektronového přechodu, ale obvykle kratší, než doba života excitovaného stavu • emisi dochází ze stavu, kdy již bylo dosaženo rovnovážné konfigurace • okamžitě po vyzáření světla se molekula nachází v nerovnovážném stavu → vibrační relaxace na základní hladině Franck-Condonův princip Absorpce Fluorescence 1 – rovnovážná konfigurace v základním stavu 2 – nerovnovážná konfigurace v excitovaném stavu (Franckův-Condonův stav) 3 – rovnovážná konfigurace v excitovaném stavu 4 – nerovnovážná konfigurace v základním stavu (Franckův-Condonův stav 1 2 3 4 Franck-Condonův princip - solvatace http://en.wikipedia.org 12/12/2014 7 Absorpce energie organickou molekulou • absorpce je zpravidla způsobena přechody vazebných (případně nevazebných) elektronů v molekule do antivazebných molekulových orbitalů • u složitějších molekul se většinou jedná o kombinaci několika přechodů Typy přechodů E π * π * π * π ππ S0 S1 T1 různé elektronové konfigurace π – elektronového systému S1 – singletový excitovaný stav (elektrony mají opačný spin), přechod je spinově dovolený (je pravděpodobný), výsoká intezita absorpce. T1 – tripletový stav, elektrony mají stejný spin, tzv. zakázaný přechod (= méně pravděpodobný), poskytuje pásy s nižší intenzitou, energetický rozdíl je menší oproti S1 Typy přechodů E σ π n π * σ * hladiny energií molekulových orbitalů 12/12/2014 8 Typy přechodů Přechod σ - σ* : jednoduché vazby (např. C-C, nebo C-H), vyžadují velikou energii (méně než 190nm, vakuová oblast) Přechod n - σ* : nutná přítomnost atomu s volným elektronovým párem (N, S, I, Cl, Br), absorpce kolem 200nm. Přechod π – π*: sloučeniny s dvojnými a trojnými vazbami, čím lepší konjugance vazeb, tím vyšší vlnová délka (energetická hladina nejvyššího obsazeného vazebného orbital se zvýší a energetická hladina nejnižšího nevazebného orbitalu se sníží → nižší ΔE), delokalizované π orbitaly aromatických systémů → rozdíl energií je nízký (absorpce ve Vis oblasti) n – π*: v molekule je kromě dvojné vazby přítomen také atom s volným elektronovým párem (N, S, Cl...), nízká energie, ovlivnění π – π* přechodu Typy elektronových přechodů v komplexech kovů a) přechody v rámci iontu kovu vázaného do komplexu (dd, nebo f-f přechody): dochází ke štěpení podhladin iontu kovu vlivem ligandového pole. b) C-T (charge-transfer) přechody: přenos náboje mezi ligandem a iontem kovu, dochází k přechodu elektronu z orbitalu atomu s výrazně vyšší elektronovou hustotou do orbitalu jiného atomu s menší elektronovou hustotou (buď přechod M-L, nebo L-M), tyto přechody mají vysokou intenzitu v porovnání s přechody d-d. c) elektronové přechody v rámci ligandu vytvořené vlivem elektrostatické interakce s iontem kovu. Mezisystémový přechod singlet- triplet • tripletová hladina leží níže, než hladina S1 (elektrony se stejným spinem se tolik neodpuzují, jako v případě stavu S1) • přechod z S1 do T1 se děje podobným mechanismem jako je vnitřní konverze • tento proces zahrnuje změnu spinu elektronu a je málo pravděpodobný (tzv. spinově zakázaný přechod) • „spinově povolené“ vibrační procesy (vibrační relaxace a vnitřní konverze) trvají ~10-14 s, zatímco „spinově zakázané“ procesy ~10-8 s (srovnatelné s fluorescencí) Rozdělení luminiscence podle zdroje excitace • fotoluminiscence - absorpce energie ve formě světla • chemiluminiscence a bioluminiscence - zdrojem energie je chemická, nebo biochemická reakce • elektroluminiscence –zdrojem je el. proud • thermoluminiscence – zdrojem je tepelná energie • radioluminiscence – zdrojem je radioaktivní záření • triboluminiscence – zdrojem je mechanická energie • krystaloluminiscence – krystalizace je doprovázena luminiscencí • další zdroje (sonoluminiscence, atd.) 12/12/2014 9 Zhášení luminiscence (luminescence quenching) • luminiscenci konkuruje jiný děj, který vede k poklesu intenzity luminiscence • všechny možné procesy zhášení ještě nejsou zcela vysvětleny • dynamické (někdy též kolizní) a statické zhášení Zhášení luminiscence • statické zhášení: ke „komplexaci“ dochází v základním stavu (vytvoří se nefluoreskující komplex). Luminiscence jsou pak schopny jen disociované molekuly, ale rychlost disociace je malá ve srovnání s se zářivými přechody (zářivé přechody jsou neefektivní). Typický příklad – komplexace těžkým kovem (snížení fluorescence kys. salicylové po komplexaci Fe(III).) F0/F = 1 + Ka[Q] Dynamické zhášení luminiscence • k interakci mezi zhášečem a potenciálním fluoroforem dojde po excitaci, kdy excitovaná molekula vytvoří „komplex“ s jinou částicí (molekulou, „species“),který nefluoreskuje – dojde k vytvoření nových hladin a dojde k deexcitaci vnitřní konverzí. Typická je např. tvorba komplexu s kyslíkem rozpuštěným v rozpouštědle (oxidace), I-, Cs+, akrylamidem, atd. F0/F = 1 + KSV [Q] • Stern-Volmerova rovnice: F0 je intenzita fluorescence bez zhášedla, F je intenzita fluorescence se zhášedlem, KSV je Stern-Volmerova zhášecí konstanta, Q je koncentrace zhášedla • dynamické zhášení snižuje τ Dynamické zhášení Zhášení fluorescence fluoresceinu za přítomnosti I- 12/12/2014 10 Excited molecule Photon emission (fluorescence) Intersystem crossing Delayed fluorescence Phosphrescence Excitation Internal conversion Intramolecular charge transfer Conforamtional change Electron transfer Energy transfer Proton transfer Photochemical transformation Formation of excimer (or exciplex) Possible de-excitation pathways of excited molecules Dexter electron transfer - theoretically proposed by D. L. Dexter in 1951 - NOT that DEXTER from TV series! - so called Dexter energy transfer - is a (fluorescence) quenching mechanism in which an excited electron is transffered from one molecule (a donor D) to a second molecule (an acceptor A) via non radiative way pat - wavefunction overlap between acceptor and donor is required - only short distances (typically within 10 Å) - Rate of ET is proportional to J spectral overlap - r is the separation of D from A - L is sum of Van der Waals radii of the D and the A Förster resonance energy transfer - so called fluorescence resonance energy transfer (FRET) - Theodor Förster was german physical chemist - ET between two chromophores (donor D and acceptor A) with appropriate spectral properties - D may transfer energy to an A through nonradiative dipole-dipole coupling - efficiency of this ET is inversely proportional to the sixth power of the distance between donor and acceptor - The method (FRET) is often used in analytical chemistry and biochemistry Vliv prostředí na luminiscenci 12/12/2014 11 Vliv vnějšího prostředí na fluorescenci • okolní prostředí (rozpouštědlo, pH, atd.) má ve fluorescenční spektroskopii větší vliv na výslednou podobu spekter, než spektrofotometrie (UV-Vis) • větší vliv okolí na molekuly v excitovaném stavu ? Absorpce Fluorescence 1 – rovnovážná konfigurace v základním stavu 2 – nerovnovážná konfigurace v excitovaném stavu (Franckův-Condonův stav) 3 – rovnovážná konfigurace v excitovaném stavu (závisí na okolí molekuly) 4 – nerovnovážná konfigurace v základním stavu (Franckův-Condonův stav 1 2 3 4 Vliv rozpouštědla • možnosti interakcí mezi molekulou analytu a rozpouštědla: dipól-dipól, dipól-indukovaný dipól, vodíkové můstky... • rozpouštědla, která tvoří vodíkové můstky mají vliv na n-π* přechody (tato rozpouštědla se chovají jako velmi slabé Brønstedovy kyseliny a atomy s nevazebnými elektrony jako zásady a částečně přijímají proton) • polarita rozpouštědla nejvíce ovlivňuje π-π* (polární rozpouštědla snižují energii π*) Luminiscence molekuly je charakterizována: emisní spektrum (emisní maximum), excitační spektrum (excitační maximum), Stokesův posun, kvantový výtěžek, čas vyhasínání luminiscence 12/12/2014 12 Emisní a excitační spektra emisní spektrum (fluorescenční resp. fosforescenční spektrum): závislost intenzity luminiscence na vlnové délce. Měří se při konstantní lex. excitační (aktivační, „absorpční“) spektrum: závislost absorpce luminoforu (fluoroforu) na vlnové délce. Měří se při konstantní lem. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 450 500 550 600 650 λ [nm] IF Emise Excitace λex, max λem, max Stokesův posun Emisní spektrum Excitační spektrum Excitační a absorpční spektrum mají podobný tvar, jestliže absorbuje pouze ta část molekuly odpovědná také za fluorescenci Emisní a excitační spektra • Stokesův posun: rozdíl mezi emisním a excitačním maximem (v nm) • Kashovo pravidlo: tvar emisního spektra není ovlivněn vlnovou délkou excitace a lze excitovat zářením s kteroukoli vlnovou délkou z excitačního spektra • nejvyšší intenzitaluminiscence: excitace vlnovou délkou rovnou excitačnímu maximu • fosforescenční spektra jsou posunuty k vyšším vlnovým délkám, neboť přechod z T1 do S0 je spojen s menším rozdílem energie, než přechod z S1 do S0 12/12/2014 13 Zrcadlové pravidlo • emisní a excitační spektra organických látek mají podobný tvar, ale jsou zpravidlazrcadlově obrácené Rhodamin 6G 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 450 500 550 600 650 λ [nm] IF[a.u.] Emise Excitace Emisní spektra Aditivní pravidlo: fluoreskuje-li po ozáření ve vzorku více nezávislých fluoroforů, výsledná emise je součtem příspěvků emisí těchto látek. Toto pravidlo však platí pouze pro molekuly, které spolu nevyměňují energii... Fluorescence a fosforescence Čas vyhasínání fosforescence – 10-4 až několik s Čas vyhasínání fluorescence – 10-12 až 10-6 Fosforescence: posun emise k vyšším vlnovým délkám 12/12/2014 14 Základní vztahy A = c l ε = log (Φo/Φ) (Lambert-Beerův zákon) A – absorbance, c – koncentrace, ε – absorbční koeficient, l – tloušťka kyvety, Φo - záření vyslané na vzorek, Φ - záření prošlé vzorkem F = k φ Φo (1-10-clε) F – fluorescenční signál (fotony/s), k – podíl emitovaných fotonů, které dorazí na detektor, φ – výtěžek luminiscence F = k φ Φo 2.3 c l ε zjednodušený vztah pro nízké koncentrace „Čas života“ (lifetime) fluoroforu • nestudujeme jednu molekulu s fluoroforem, ale mnoho molekul s populací elektronů na excitovaných hladinách • na základě studia systému z mnoha molekulami určujeme „čas života“ určité molekuly s fluoroforem dn*/dt = -n* Γ + f(t) n* je počet excitovaných částic, t je čas, Γ je rychlostní konstanta emise fluorescence, f(t) je časová jednotka (čas excitace) • jestliže k excitaci dojde v čase t = 0, pak: dn*/dt = -n* Γ pro počet excitovaných molekul lze rovnici zapsat takto: n*(t) = n*(0) exp Γ t jestliže: τ = Γ-1 pak: n*(t)/n*(0) = e - t/τ τ je tedy čas, kdy 1/e molekul (36.8%) je v základním stavu Čas života luminiscence křivka vyhasínání má pro stejné „species“ exponenciální průběh n*(t)/n*(0) = e - t/τ 12/12/2014 15 Vyhasínání luminiscence • počet excitovaných částic je úměrný intensitě luminiscence: It = α e - t/τ Vyhasínání luminiscence • jestliže je v systému více komponent („species“), které po excitaci za daných podmínek vykazují luminiscenci, potom má výsledná křivka multiexponenciální charakter • obecná definice: φ = kf / (kf + ki + kx) kf rychlost emisního procesu (fluorescence) ki rychlost nezářivých přechodů (teplo, relaxace...) kx rychlost mezisystémových přechodů - jestliže rychlost deaktivačních procesů je pomalá ve srovnání s kf potom kvantový výtěžek je vysoký • kvantový výtěžek: φk = Nem/Nabs = Iem/Iabs = Iem/(I0-I) • energitcký výtěžek: φe = Eem/Eabs = hνem/hνex Výtěžek luminiscence φeφk (Stokesův posun) 12/12/2014 16 Stanovení kvantového výtěžku 1) absolutní stanovení (primární metody) • chemický aktinometr • kalorimetrie • kalibrované zdroje záření, korekce spekter, integrační koule atd. 2) relativní stanovení (sekundární metody) • srovnání s fluorescenčním standardem Chemický aktinometr • roztok šťavelanu železitého absorbuje všechno záření o vlnové délce menší než 490nm • absorbované záření se velikou účinností redukuje Fe(III) na Fe(II) • titračně lze určit kolik Fe(III) se přeměnilo na Fe(II) a následně spočítat kolik fotonů prošlo systémem • uspořádání chemického aktinometru pro určení kvantového výtěžku: kyveta se vzorkem je obklopena aktinometrickým roztokem, kromě malého okénka, které propustí do vzorku excitační záření. Emitované záření je pak zachyceno do aktinometrického roztoku. Stanovení kvantového výtěžku Stanovení kvantového výtěžku kvantový výtěžek: φk = Nem/Nabs • pro stanovení kvantových výtěžků používáme fluorescenční standardy (tj. látky s definovaným kvantovým výtěžkem) • potřebujeme znát molární absorpční koeficienty (nebo hodnoty absorbancí při stejné koncentraci) stanovované látky i standardu pro vlnovou délku excitačního záření • změříme a porovnáme plochy (F) emisních spekter Fx Fst x εst εx φ φx = st 12/12/2014 17 Stanovení kvantového výtěžku - problémy • vnitřně filtrační efekt (samoabsorpce) • různá citlivost detektoru pro různé vlnové délky • proměnlivá intenzita excitačního zdroje • korekce na refrakční index • polarizační efekt • nečistoty ve standardech • rozptyly (Raman, Tyndal)