Osnova 4. ppednápky ô Genetické metody Plasmidy Integrace " Teplotna-sensitivní mutanty " Tetrádová analýza Syntetická letalita, suprese Výhody kvasinkového modelu ô Rychle se mnoiící EUKARYOTNÍ mikroorganismy (90 min/dalení, 25-30°C) ô Vytváp kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování ploten, kapkovací test =>toxiny v plotnách " HU, MMS ú ) ô Stabilní haploidní i diploidní formy ô Haploidní buKky lze kpiit na diploidní (heterozygotní mutanty) ô Diploidní buKky lze sporulovat a vyuiít pro genetickou analýzu (tetrádová analýza) ô Lze transformovat DNA (plasmidy i lineárni) ô Centromerické a multicopy plasmidy ô Vysoká frekvence homologní rekombinace (lineárni DNA) ô Lze pppravovat deleľní a mutantní kmeny ô Vydrcí v >15% glycerolu na -70°C Kndefinitely' ô Techniky barvení (napp aktinový cytoskelet = phaloidin, bunaTná stana + GFP in vi vo) ô Techniky synchronizace bunak 9 % : c • • # • • • • • m m . g f 9 4 r> t, y ô S.c. má kompaktní génom " knihovny s genomovou DNA (ne cDNA) ô Kompletná osekvenovaný génom (genomové aplikace) ô EuroFan projekt " delece vpech S.c. genLu(+GFP, +2-hybrid) ô MikroTipy - expresní profily za různých podmínek ô n ada xivotních dajLumá analogii v procesech v savTích biiKkách (lidské geny testovány v kvasinkách - nemoci, metabolismus, regulaTní mechanismy) Chromosom III (nejmenpí) CEN, ARS, TEL, Ty1 -5 obsahuje MAT lokus Nomenklatura pro S.c. YCRXXw: Y=yeast C= 3. Chromosom R= pravé raménko XX=popadové Tíslo w/c=Watson/Crick LEU2 ~ gen Leu2p - protein leu2A ~ delece Ieu2-1 ~ mutace (identifikaTní Tíslo alely) LEU2::HIS3 " inzerce HIS3 genu v lokusu LEU2 Forsburg: NRG, 2001 Baudat a Nicolas, PNAS, TBw 74w TSvtr Ty5-1 CHA1 62w Sic«řc 59c PfíOt 55 jr 63\v 58c SSc 1 . II . I ,1 1 54* f SSc SfwAPAI 49c 48w 47c *Sc| 44c PLUJ 53c A 4Sw ARS305 4Jc 42ur %BLK1 39ur 38c 37c 3Svr ' 34-wSTESO HÍS4 BK3 28w fVSl JBc 25c 1 24vf M 21vALEU2$PL1 T 35c 33c 31c i ÍJe _ I-1 GDP2 10c 9c Ji SSK22 EDSf SOL2 7Sc 98c 99c l 106 Table 1 Nomenclature in the two yeast species S. cerevisiae S. pombe YFG1 yfgl* Ayfgl yfglA Ayfgl yfg1& yfg1-1 yfg1-1 YFG1-2 yfg1-2 Yfg1YFG1p Yfg1yfg1p ™ Wild-type gene Deletion (null) mutant Recessive mutant Dominant mutant Protein 1997 Yfg typicalry Tieans your favourite gene'. The 'p' designation lor proteins (for example. Yfgtp) ts occasionally used 5 cerovziae, Saccharorrryces cerevisiae or budding yeast; S. pombe, Schizosaccharomyces pombe or fission yeast Laboratorní kvasinkové kmeny S. pombe " K501% Genotype: h- ura4-A18 leu1-32 ade6-704 ATCC S. Cerevisiae " KS288Cx " 1. osekvenovaný kmen Genotype: MAT SUC2 gal2 mal mel flo 1 flo8-1 hap 1 Notes: Strain used in the systematic sequencing project, the sequence stored in SGD. S288C does not form pseudohyphae. In addition, since it has a mutated copy of HAP1, it is not a good strain for mitochondrial studies. S288C strains are gal2- and they do not use galactose anaerobically. References: Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43. IN PARTNERSHIP WITH LGC STANDARDS Sources: ATCC:204508 KW303' " nejTastaji pouiívaný laboratorní kmen Genotype: YWATa/MAT~lleu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15 Notes: W303 also contains a Dua4 mutation that causes haploids to bud with a mixture of axial and bipolar budding patterns. In addition, the original W303 strain contains the rad5-535allele. References: W303 constructed by Rodney Rothstein Sources: Biosystems:YSC1058 Dvoj hybridní systém: Strain AH 109 Y187 CG-1945 Genotype References MATa, trpí-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gai4A, gal80A. LYS2:: GAL 1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3:: MEL 1UAS-MEL1 rATA-lacZ MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4A, met-, gal80&, URA3:: GAL fUAS-G/U iTATA-/acZ MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, Iys2-801, trpl-901, feu2-3. 112, gal4-542, gal80-538. cyhr2, LYS2. URA3:: GAL4 GAL1UA5-GAL1T^-HIS3. James et at., 1996; A. Holtz, unpublished Harper etal., 1993 Feilotter era/., 1994; C. Giroux, pers. comm. 17-mers(x3) ~GYC 1fAfA~lac2l Allele Reverts? Notes Molecular description3 Reference ade2-101 yes ochre mutation, red colonies G to T transversion at nucleotide 190, changing amino acid 64 from a Glu to a STOP Gai and Vovtas, 2005 his3-200 no Cold sensitive; high frequency of petite formation, especially during transformation. 1 kb deletion, (-205 to 835) Struhl 1985; Fasullo and Davis 1988 leu2-3,112 no double mutant GTT-to-GCT missense change at codon 69, G insertion at nucleotide 249, G insertion at nucleotide 792, GAC-to-AAC missense change at codon 300. Hinnen et al. 1978; Gaber and Culbertson 1982; trpl-1 yes amber mutation GAG-to-TAG amber (STOP) nonsense change at codon 83 McDonald, et al. 1997 ura3-52 no - Tyl insertion Rose and Winston 1984 Genotype References MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, James etal., 1996; ga/4A, gal80A. L YS2 : GAL lUAS-GAL 1TATA-HIS3, A. Holtz, unpublished GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3 :: MEL 1UAS-MEL1 TATA-lacZ MATa, um3-52, his3-200, ade2-101, trp 1-901, Harper etal., 1993 leu2-3, 112, gal4A, met-, galSOA, URA3 :: GAL 1UAS-GAL 1TAlA-lacZ MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, Iys2-801, Feilotter etal., 1994; trp1-901, leu2-3, 112, gal4-542, gal80-538, cyff2, C. Giroux, pers. comm. L YS2:: GAL 1UAS-GAL1TATA-HIS3, URA3 GAL4 „Mx3rCYC1Tm-lacZ Table 2 | Corresponding tools In the two yeast species S. cerevtsiae S. pom be Selekce Forsburg: NRG, 2001 Regulated promoter Piasmid replication origins Auxotrophic markers Uracil, orotidine 5'-phosphate decarboxylase Setect aganst vvrth 5-FOA Leucine, p-isopropylmalate dehydrogenase Adenine, phosphonbosyl-aminoimidazc4e carboxyk Accumulates red colour GAL (galactose regulated) nmt (thiamine regulated) ARS1 or 2p ars1 URA3 LEU2 ADE2 ura4* adeS- 2(j (2 micron), an endogenous piasmid DNA moteaJe found h some yeast eels, with a dramferencs of 2\i; 5-FOA, 5'-fluoro-orotic add. S. oarevrsse, SaccteromycGS careveae or budding yeast; S. pombo. Scheosaccharomyces pembo or fission yeast - geneticin (G418) " podobný kanamycinu (mistranslace) - nourseothricin (NAT) " inhibitor ribosomalní proteosyntézy = miskodování {Streptomyces noursei), rezistence pomocí nati genu (N-acetyltransferasa " monoacetyluje NAT) - hygromycin B " inhibuje translokaci v prubahu translace (aminoglykosid z Streptomyces hygroscopicus), rezistence kódována hph genem z Klebsiella pneumoniae - phleomycin " interkaluje se do DNA a způsobuje DSB (zlomy, glycopeptid z Streptomyces verticulus), rezistence kódována ble genem z S. hindustanus Shuttle vektory 6 vychází z 2jim plasmidLunebo centromer (S.c; 2jim pptomné také v Zygosaccharomyces bailii, Z rouxii a Kluyveromyces drosophilarum) 6 Kvasinková Tást" marker (URA3, NAT ů ), CEN-ARS (1 kopie) nebo 2jim (-50 kopii na haploidní buKku) zaTátek replikace 6 Bakteriální Tást" Kan resistence, replikace a Promotor, tag, MCS Kondicionální mutanty (fenotyp-funkce) Nadprodukce (suprese mutací nebo toxicita) Promoter Regulation/ Relative Protein Expression Level Signal Strength on Western blot b Kpnl EcoRI BaiiiH 1 URA3 ADH1 (full-length) ADH'iiAIQ bp+)c A0H/(41Obp) ADH1 (700 bp) GAL1 (full-length) MET1 CUP1 MFA1 Ethanol-repressed/H igh Constitutive/medium Constitutive/low Constitutive/ very low Consitutive/high - + +/- (weak) (not detectable) +++ ARSH4 CEN6 Repressed by glucose; (not detectable)d induced (high-level) by galactose +++d Methionin repressed Indukovány madí MATa specifický (haploid specifický) Kan Table 1. Summary of pFA6 derivatives for genomic FLAG and PK-taggiug and geue deletiou useful iu .S'. pombe. Vector name Comments Markers. Sources pFA6a-6xGLY-VHi™rker) C-terminal G6-lPK(V5)-tagging KanMXÖ hphMX4 (S) (S) KanMXÖ This study FK-taggiiig lectors hphMXÖ This study pFA6a-12PK-(maker) C-teimtnal 12PK(V 5)-tagging natMXÖ LEU2MX6 ura4MXö This study This study This study KanMXÖ (4) pFA6a-5FLAG-(ruaker) C-temiiufll IJFLAG-tagging hphMXÖ natMXÖ bleMXÖ (4) (4) (4) pFA6a-6xGLY-FLAG-(ruaker) C-teimiaal Go-FLAG-tagging KanMXÖ hphMX4 (S) (8) pFA6a-6xGLY-3FLAG-(ruaker) C-ternunal G6—3FLAG-tagging KanMXÖ hphMX4 (S) (S) kanMXÖ (4) FLAG-tagging vectors hphMXÖ (4) pFA6a-(marker)-Punit 1-3 FLAG * N-terminal 3FLAG-tagging natMXÖ bleMXÖ his3MXÖ (4) (4) (4) kanMXÖ (4) pFA6a-(marker) Purg 1-3 FLAG * * N-terminal 3FLAG-tagging hphMXÖ natMXÖ bleMXÖ (4) (4) (4) pFA6a-G9/Gl l-5FLAG-(iuaker) C-termioal G9G1 l-5FLAG-tagging kanMXÖ kanMXÖ This study kanMXÖ (2,15) hphMXÖ (10) pFA6a-GFP(S65T) -(mater) C-tenikioal GFP(S65T)-tagging natMXÖ bleMXÖ ura4MXÖ (10,16) This study This study GFP-tagging vectors pFA6a-(marker)-Punitl-GFP(S65T>* N-ternunal GFP(S65T>tagging kanMXÖ natMXÖ (?) (16) kanMXÖ (10) pFA6a-mRFP- (maker) C-terminal niRFP-taggiiig hphMXÖ natMXÖ uraMXÖ (10) (10) This study kanMXÖ Q) hphMXÖ (9,10) natMXÖ (9,10) Disruption pl.ismich pFA6a-(maker) For gene deletion bleMXÖ ura4MXÖ his3MXÖ LEU2MXÖ (9,10) This study This study This study *Expressed under the control of the nmtl promoter: Pinmtl and its weaker derivatives P41nmtl and PSlnmtl are available. **Expressed under the control of the urgl promoter. YAC (yeast artificial chromosome) 6 Bakteriální Tást" Amp resistence, poTátek replikace 6 Kvasinková Tást" marker, CEN-ARS, TEL 6 50-500kbp insert napp lidská genová banka pro HuGO 80000 klonniYAC (270kbp) 5 Klonování, mnoiení, uchování dlouhých fragmentLuDNA 6 Výzkum savTích telomer a centromer 6 Pomocí transfekce, lipofekce nebo elektroporace lze dostat YAC i do savTích bunak " náhodná se integrují do genomu - výzkum nesestphnutých genw (dlouhé regulaTní úseky) ARSl TRPÍ, CEN4 o:: TEL BartůH m. Notl Sim\ Cloning site SJil. Nůň I Ä7"íHI, Smol, Phosphatase TRPÍ ARSl OEiVJ Restriction fragment TransformaTní protokol á Exponenciální kultura á Opláchnout vodou a TE/LiAc roztokem á Rozsuspendovat v TE/LiAc roztoku a ppdat DNA (plasmidová/cirkulární i lineární DNA) ó Ppdat TE/LiAc/PEG4000 roztok ó 30 minut na 30°C a poté teplotní pok pp 42°C (15min) á StoTit a pelet rozsuspendovat v TE roztoku á Rozetpt na selektivní plotnu Yeast surface display B GPMH6/pMCGI GPMH6/pMCGI (100 uM CuS04) (without CuS04) - vyuíití i pro biotechnologie " vychytávání taikých kovLu(dekontaminace) ^mP - 6xHis-Aga2 (vychytání Cu) integrován v genomu -CUP1-GTS1 (indukce aglutinace) na plasmidu i i GAPOH \ pronwter J H TRPÍ art GTS1 CUP i promoter Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) Integrativní plasmidy nemají CEN ani 2jim Tásti Not I oř eg/II Transcription Termination (TT) Sail Stul Not I or eg/II - integrativní plasmid pro P. pastoris (GS1115, genotype: his4) - exprese z AOX1 promotoru v Rpastoris Feature Description Benefit 5'AOXl An -1000 bp fragment containing the AOXl promoter Allows methanol-inducible high level expression in Pichia Targets plasmid integration to the AOXl locus. DNA sequence coding for an N-terminal protein secretion signal Targets desired protein for secretion MCS Multiple Cloning Site Allows insertion of your gene into the expression vector TT Native transcription termination and polyadenylation signal from AOXl gene {-260 bp) Permits efficient transcription termination and polvadenvlation of the mRNA H1S4 Pichia wild-type gene coding for histidinol dehydrogenase (-2.4 kb) and used to complement Pichia Itis4 strains Provides a selectable marker to isolate Pichia recombinant strains 3'AOXl Sequences from the AOXl gene that are further 3' to the TT sequences (-650 bp) Targets plasmid integration at the AOXl gene Amp pBR322 origin Ampicillin resistance gene E. coli origin of replication Allows selection, replication, and maintenance in £. coli f 1 origin Bacteriophage fl origin of replication (458 bp) Permits generation of single-stranded DNA for mutagenesis Not I Bglll Sac I Sall Stul Unique restriction sites Permits linearization of vector for efficient integration into the Pichia genome Not I or BgiU Transcription Termination (TT) Integrace Not I or eg/ II AOX1 Gene of Interest TT - integrative plasmid pro P. pastoris (GS1115, genotype: his4) - exprese z AOX1 promotoru - integrace do AOX1 lokusu 3 AOX1 x Linearized plasmid Pichia genome (Ns4) HIS4 3' AOX1 Plasmid integrated into genome MCS Integrace Transcription Termination {TT) integrace do his4 lokusu Sali Stu I Not I or ßg/li Transcription Termination (TT) Integrace Not I or BglH AOX1 or aox1::ARG4 5 AOX1 or aox1::ARG4 integrace do AOX1 lokusu Pich i a Genome (his4) 5" Paoxi^Z Gene of Interest TT HIS4 Z 3' AOX1 Expression Cassette 5' AOX1 or aox1::ARG4 TT 3' 2nd Insertion Event 'Expression / E xprcssionV .. (mr^ \ Cassette 1 J^zZSXtyiĚEty 3' AOX1 Z I 5" PAOjfiiG»"« of Interest TT HÍS4 \Zy AOX1 Expression Cassette 2 3rd Insertion Event, etc. u Pichia pastoris dochází u 1-10% transformantuik vícenásobné integraci " vyppí exprese Pomocí jiného markeru lze integrovat dalpí kazetu Disrupce/delece genu Studium funkce genu " fenotyp (1. delece, 2. mutace) - nezbytný/esenciální gen => buKky potpebují gen napp na plasmidu (plasmid shuffling) - xivotaschopné " mutace lze ppmo integrovat do genomu - mutantní kmeny se testují na citlivost k různým Woxinmnx" dále je lze kpxit s funkTna podobnými geny-mutantami a hledat jejich funkTní vztahy (synthetic lethal x epistatic x supresei^ 1-krok 2. krok f I yrai I I yigi-1 I í 1 UraH I UPA3 o: FOASelection(Uni") FOASelection(IJra") 1 specifická mutace IT neesenciální gen Vyuíití inhibitoru FOApro K)dléTenP URA3 markeru (FOAje ppemaKována Ura3p dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil => URA3+ buKky nerostou, zatímco ura3- buKky jsou rezistentní) BuKky se stávají ura-, takie URA3 marker lze vyuiít nakolikrát Delece genu - PCR 6 pro rekombinaci staTí pouze krátká homologie (50-1 OOnt pro S.c.) 6 oligonukleotidy ~ 70nt dlouhé postaTí (pp 2 krokové PCR se kroma dlouhé homologie vnesou jepta specifické sekvence pro pozdajpí manipulace ů ) kanMX kanMX kanMX 1 .PCR (barcode) 2.PCR (homologie) Kvasinkový ORF systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan kmeny lze získat z archivu EUROSCARF http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html EUROPEAN SACCHAROMYCES CEREVISIAE ARCHIVE FOR FUNCTIONAL ANALYSIS MX6 kazety - nourseothricin (NAT) " inhibitor ribosomalní proteosyntézy = miskodování {Streptomyces noursei), rezistence pomocí nati genu (N-acetyltransferasa " monoacetyluje NAT) - hygromycin B " inhibuje translokaci v prubahu translace (aminoglykosid z Streptomyces hygroscopicus), rezistence kódována hph genem z Klebsiella pneumoniae - phleomycin " interkaluje se do DNA a způsobuje DSB (zlomy, glycopeptid z Streptomyces verticulus), rezistence kódována ble genem z S. hindustanus) SpoleTná struktura kazety " moinost zámany kazet (pro genetické studie " kpiení) Pme\ P Pac\ Bgl \— —► BarrM tef F2 Pac\ Bgl —► SamH I F2 tef Pac\ SamHI Ml 'tef nat ' tef EcoRM pFA6a-natMX6 1.2kb R1 Pme\ hph TrEF EmRV pFA6a-hphMX6 1.7kb R1 Pme\ ble Ttef EcoRV R1 pFA6a-bleMX6 1kb Hentges et al.: Yeast, 2005 Goldstein et al.: Yeast, 1999 Cre rekombinasa ESSENTIAL o- pUC* I ľ< K r.-rj] u# |r-T. diploid Guldener et al, NAR (1996) NON-ESSENTIAL Watson et al> Gene= 2008 CPTS --^1 -ara4'-Hfo-- PCR product size /_\ 2.2 kb »»- -El-ere* T- t ♦Cre cpr PCR product size 3.6 kb Postup lze pouiít nakolikrát se stále stejným markerem Nevýhoda pro genetické studie (marker nekosegreguje s mutací) Ppprava monomerujpro výrobu plastuj " vyuiití Candida tropicalis ô Candida tropicalis je schopna vyurít mastné kyseliny jako zdroj uhlíku (acetyl-CoA) ô mutantní kmen (APOX4, APOX5) není schopen (3-oxidace a ppemaKuje je OXidaCÍ na di-karbOXylOVé kyseliny (Picataggioetal, Biotechnology, 1992) ô pomocí flp rekombinasy odstranili geny oxidás (4 alkohol oxidásy) a dehydrogenás (6 alkohol dehydrogenás), aby eliminovali co-oxidaci ô nový kmen je schopen produkovat co-hydroxymastné kyseliny, které Fatty add lze pouiít pro výrobu bio-polymeruj ******* J (plastujpodobných polyetylénům, ch^ch^-cooh chhch^-cooh bio-odbouratelné na bio-palivo) )|C ô dalpí modifikace kmene .-*-. ch^ch^^h cti CnA ttihfcm ô dalpi modifikace kmene .-1-. chhch^h:h=ch-co-k-í:oa (integrace genujpro lipasy) 1-rp-r^-1 11 iji iitřyidut; ytři iLupiu lipasy; -^ ^- by umoinilo ppmé odbourávání™ *n"rm"Ä A ch^ch^^oh^ivcxj-s^CoA odpadních olejujú omc-(ch1)b-cooh [ " " CHr(CHa)^1-s-CoA Lu et al., JACS (2010) dto" Ar of glucose ► ► PEP OCA > H3p04 4 E4P AroB D AH P DHQ AroD Cas9 zaintegrován nejdpve DHS Aro1 J aromatic amino acids AroZ ^* AmY ^ ~0" AroY, CAT A PCA catechol cts.c/s-muconic acid C02 Q2 Target Cleava9e CRISPR-Cas9 systém byl pouiit v S. cerevisiae ke vnesení nové metabolické dráhy v jednom integraTním kroku do 3 lokusu (GAL80 delece " dereprese galaktosove drahý) dsDNA P AM GALSO US AroY AroY nrln\ ;óno QAL4 ^1 GAL80 DS Insertion/ deletion New DMA Non-homologous end joining (NHEJ) Donor ONA multiple AroY kritický krok zvýoí výtaiek HO US AroF AroY AroY (AR01 delece blok metabolismu aromatických AMK) AroY AR01 US CATA AroZ New DNA Homology directed repair (HDR) AroB AroD AR01DS úTinnost vpech 6 integrací najednou pouze 5% Dosaieno syntézy kyseliny mukonové - plasty Horwitz et al, Cell Syst, 2015 EuroFan projekt - testy fenotypu Assay/growlh conditions YPD + 8mM caffeine Cycloheximide hypersensitivity: YFD + 0.08 ng mJ"1 cyclohoximide at 30 CC V\hite/red colour on YPD YPGtycerol (— Calcofluor hypersensitivity: ypd + 12 /iQ fl"' calcofluor at 30 °C ypd + 46 jug mr1 hygromycin at 30 "C ypd + 0.003% sds Benomyl hypersensitivity: ypd + 10 pig ml"1 benomyl | |\/|JkrOtUbuly ypd + 5-bromo-4-cNorc-3-indolyl phosphate at 37°C (stabilizující) ypd + 0.001 % methylene blue at 30 CC Benomyl resistance: ypd + 20 ngmH benomyl I Mikrotubuly ypd at 37^ (destabilizuj ÍCÍ) ypd + 2 mM EGTA ypd+ 0.008% mms BunaTná stana (stabilizující) ypd + 75 mM hyctoxyurea ypd at 11 qs Oprava DNA - Calcofluor resistance: YPD + 0.3 ujgmr' calcofluor at SO^cj Bij n. Sta na - Cyctohexhiide resistance: ypd + 0.3Mgrnl"1 cycbhexirricte (dCStabilíZUJÍCÍ) ^— HyperhaploJd invasive growth mutants - ypd + 0.9 M Nad tBenR Cyc5^ t Systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan FunkTní kategorie genuj" anotace v databázích (genová ontologie) ~ 6000 heterozygotních deleTních kmeniu ~ 5000 homozygotních deleTních kmeniu(+ ~ 1000 esenciálních genu) (neesenciální" rust za specifických podmínek nebo redundantní procesy) Lethality (Giaever et al, 2002) Growth detect in rich medium (Deutschbauer et al.. 2005) Growth detect in this study No phenotype in this study - Testováno -400 malých molekul a stresových podmínek (-aa ...) - Celkem provedeno ~ 6milionuj testuj - multidrug resistance (MDR) pokud byl gen potpebný pro resistenci vůli >20% z testovaných látek B Podobné profily svadTí o funkTní podobnosti Hydrogen peroxide, pH8 MMS, MPP+. Paraquat, Sodium arsenate \__ " PEX5 PEX22 PEX19 PEX14 PEX8 YGL152C YJL211C PEX1 PEX3 PEX10 PEX4 PEX13 PEX6 PEX17 PEX12 PEX15 Peroxisome (P=6xirj26) Resistant! Geny/Proteiny peroxisomu Science 320 (2008), p.362 Sensitive 410 homozvaous exD^rimífils Plasmid shuffling Pokud je YFG1 esenciální musí být v deleTní mutanta pptomna extra divoká kopie genu napp na plasmidu Na dalpím plasmidu muie být vnesena mutovaná verze yfgl ~ její efekt se projeví ai po odstrananí plasmidu s divokou kopií genu (pomocí FOA) Podobna lze pouiít ade2, ade3 systém s YFG1 wt genem na plasmidu s ADE3 (kolonie jsou Tervené díky ade2 mutaci) " po ztráta plasmidu jsou sektory kolonii bílé (bez Ade3p enzymu je metabolická dráha blokována dpVe nei vzniká Tervený metabolit) ts mutanty - ts mutanty jsou výhodné pro studium funkce esenciálních gemu" mutanty jsou normální na permisivní (25°C) teplota, ale nemohou dokonTit bunaTný proces vyxadující aktivní protein za restriktivní teploty (37°c) - ts mutanty = vatpinou nestabilní proteiny, které se pp zvýpené teplota denaturují/ztrácí aktivitu a jsou degradovány domain 1 domain 2 domain 3 Ubiquítifi DHFR** protairt of iffi&rtat reo HaiHife in S. cerevisius ~1 Phenotypes with ' Ptienotypes with Ura3 as domain 3 usni j ubrlA ; ubm íl«nbit3Jítliiatíť,rj (colramJattonaf) long hört long ubrlA Ura+ long Ura+ Ura+ Cdc38 as domain 3 UBR1 UbrlA growth growth arrest growth - ubiquitinace K)znaTkuje proteiny pro proteasom (degradaci) ts alela DHFR je degradována (nestabilní protein " strukturní mutace) - fuze DHFR (ts alely) s heterologním proteinem => celý protein je na 37°C degradován - je moino vyuiít pro pppravu ts mutantních kvasinek (fuze s CDC28 " kvasinky arestují V G1 fázi) Dohmen et al.: Science, 1994 oivotní cyklus S. cerevisiae - pouzdro spory je tpeba rozrupit a pomocí mikromanipulátoru získat jednotlivé haploidní buKky (lze provést i tzv random sporulation) - u S.pombe jsou diploidní buKky nestálé a okamrita sporulují (pouzdro se rozpadá samo) - Deleci Ti mutaci lze provést v haploidní Ti diploidní buKce - v haploidní buKce hrozí suprese defektu proto je lépe pouiívat diploidní buKky (druhá kopie zůstává nezmananá) - lze pppravit dvojitého mutanta kpiením haploidních mutant a poté sporulací diploida RHOMBOEDRICKÝ S LINEÁRNÍM USPOŘÁDÁNÍM SPOR Více v dal pich ppednápkách Tetrádová analýza (S. pombe) genetické vztahy koření dvou mutant S LINEÁRNÍM USPOŘÁDÁNÍM Tetrádová analýza genetické vztahy kpiení dvou mutant Selektivní médium (SD-ura ... testy) Dvojité mutanty funkTní ppbuznost haploid x haploid => diploid " stejný fenotyp - identický gen - bez fenotypu " díky wt alele (různé geny) sporulace => haploid " stejný fenotyp " epistatický (funkTna ppbuzné geny) - aditivní ai letální (paralelní dráha, redundance, rozpad komplexu) Epistatický Proteinový komplex A / \ \ / D Letální Mutageneze pomocí hydroxylaminu ú hledání (screening) letálního mutanta mutageneze kmene s vypínatelným plasmidem (promotor nebo FOA " viz plasmid shuffling) Pomocí tachto genetických metod byly analyzovány metabolické dráhy ú proteinové komplexy ú Supresory Supresory potlaTují povodní fenotyp " mutace téhoi genu KiapravP povodní mutaci - mutace sousedního (protein) zesílí oslabenou interakci - nadprodukce proteinu z paralelní dráhy - nadprodukce proteinu z téie dráhy Ppprava aneuploidních bunak MATa, kari MS, lys2-801, cyh2-Q37E, a::HIS3 MATa, a::kanMX6, LYS2, CYH2, canl-100 KAR1 gen potpebný pro karyogamii tj. pro fuzi jader a::HIS3 + a::kanMX=> a::specifické promotory -rezistence pouze v (a) haploidních buKkách Studium vlivu aneuploidie na buKku (u Tlovaka se podílí na kancerogenezi, aneuploidie v 90% lidských nádoru) Select for: CauR.-His and KauR Torres et al, Science, 2007 Souhrn 4. ppednápky ô Genetické metody Plasmidy (kvasinkové elementy) Integrace (plasmidy PCR, kazety) Teplotna-sensitivní mutanty (esenciálních genu) " Tetrádová analýza Syntetická letalita, epistase, suprese Pomocí tachto genetických metod byly analyzovány metabolické dráhy, proteinové komplexy, evoluce biologických systémujů pppravovány nové kmeny pro biotechnologie ů pepeny otázky týkající se zdraví Tlovaka