Kvasinky a biotechnologie
Jana Kopecká
223187@mail.muni.cz
Biotechnologie „klasická“ x rekombinantní
http://distillers.tastylime.net/library/Introductiontoyeast/Introduction_to_Yeast.htm
Úvod
Odhad: 670 000 druhů kvasinek
cca 30 druhů
kontaminace výroby nápojů
1500 známých druhů
cca 20 druhů je
průmyslově využíváno
• sekvenace S. cerevisiae v roce 1996
S. pastorianus v roce 2009
• snadná manipulace – podobné s bakteriemi
– (izolace mutantů, rychlost růstu, přítomnost plazmidu, …)
• kultivace ve fermentoru
• S. cerevisiae, „P. pastoris“, Yarrowia Lipolytica, Schizosaccharomyces
pombe, Kluyveromyces lactis, …
Rekombinantní biotechnologie
http://www.alibaba.com/product-detail/Lab-scale-autoclavable-
fermentor_106304138/showimage.html
Kvasinkové expresní systémy
• vhodná posttranslační modifikace proteinů eukaryotního původu, ale trochu
jiné struktury N-glykanů → glykozylace
• možné připojení sekretorních signálů
• podíl sekretovaného proteinu z celkového množství proteinů
syntetizovaných buňkou u S. cerevisiae 1%, „P. pastoris“ až 10%
• S. cerevisiae – eutropin (Lg Chemical), Hepatitis B vakcína
(Glaxosmithkline), hirudin (Aventis), insulin (Novo-Nordisk)
Kultivace „P. pastoris“
Komagataella pastoris
• silný promotor pro alkoholoxidázu AOX – snadná indukce a regulace
• vnesení genu holomogní rekombinací (stabilnější než pomocí plazmidu)
• postranslační modifikace (odstranění signálních peptidů, glykozylace,
tvorba disulfidových můstků)
• pro expresi velkých proteinů
(>50 kD)
http://2012.igem.org/Team:Tec-Monterrey_EKAM/Modular
Kultivace „P. pastoris“
• 3-stupňový proces:
produkce biomasy (represe genové exprese) - glycerol
adaptační fáze - glycerol
produkční fáze – glycerol+metanol
• nutná optimalizace!!!
• sekretované i intracelulární proteiny
• velké denzity při kultivaci
• komerčně dostupný kit „P. pastoris Expression Kit“ (Invitrogen)
Klasické biotechnologie
• výroba piva
• výroba vína
• výroba pečiva
• výroba lihovin
• SCP = single cell protein (krmná biomasa)
• využití převážně S. cerevisiae
http://www.atlantacuisine.com/brett-oh-my-ces/
Boynton a Greig, 2014
Různé typy piv = různé podmínky
• slad
• kvasnice
• kvašení
• doba zrání
• …
http://www.pivovary-lobkowicz.cz/nase-nabidka/
Pivovarské kvasinky
• kulturní kvasinky používané k produkci spodně či svrchně kvašených piv
• čistá kultura – vyrovnaný tvar (kulatý, oválný), stabilní vlastnosti
• technologicky odlišné druhy:
S. pastorianus (spodní) a S. cerevisiae (svrchní)
– hybridní, polyploidní (tri- či tetraploidní), často i aneuploidní mikroorganizmy
• genom: S. cerevisiae S288c: 12 Mb, 16 chromozomů (1996)
S. pastorianus W34/70: 25 Mb, 36 chromozomů, 2 subgenomy typu
SC a SB, mt-genom typu SB (2009)
A, B – spodní pivovarské kvasinky S. pastorianus RIBM 95
C, D – svrchní pivovarské kvasinky S. cerevisiae RIBM 139
Fotografie C a D byly pořízeny při zvětšení 1000x.
S. pastorianus (spodní)
– hybridní původ
– hlavní kvašení při nižších teplotách (9-12°C) cca 7 dní
S. cerevisiae (svrchní)
– hlavní kvašení při vyšších teplotách (18-22°C) cca 3 dny
– tvorba ovocných příchutí v pivu
Pro každý typ piva jsou vhodné jiné kvasinky
(ležák, pšeničné pivo, IPA, ale, lambic, atd.)
(http://www.blq-weihenstephan.de/)
• 1. čistou kulturu spodních kvasinek izoloval v roce 1883 E. Ch. Hansen
(„S. carlsbergensis No.1“)
• 1. čistou kulturu svrchních kvasinek izoloval pravděpodobně v roce 1888 A.
J. F. de Bavay
Model utváření hybridních druhů
S. pastorianus a S. bayanus (Libkind et al., 2011)
Odhadem více než 10 % kmenů klasifikovaných ve sbírkách jako S. cerevisiae může být
přirozeným hybridem mezi S. cerevisiae a více či méně příbuznými druhy
(Nguyen et al., 2011)
Genom „S. carlsbergensis No.1“
Data ze sekvenace genomu „S. carlsbergensis“ byly zkompletovány se subgenomy S. cerevisiae a S. eubayanus
a bylo provedeno srovnání s referenčními chromozomy S. cerevisiae S288C. Zeleně zvýrazněné jsou chybějící
chromozomy VI, XI a XII v S. cerevisiae subgenomu a translokace mezi chromozomy II/IV a VIII/XV v
S. eubayanus subgenomu kmene „S. carlsbergensis“.
Walther et al., 2014, G3, 4:783-793.
Srovnání kmenů S. pastorianus
Mapa struktury chromozomů a počtu kopií kmene „S. carlsbergensis No.1 a S. pastorianus W34/70.
Subgenom S. cerevisiae (modrá) a S. eubayanus (oranžová). Interchromozomální translokace jsou
zvýrazněny. Translokace mezi homology chromozomů S. cerevisiae a S. eubayanus se vyskytují na různých
úsecích v obou genomech. Kmeny mají shodné tři translokace, chromozom III, VII a XVI.
„S. carlsbergensis“ je triploidní, zatímco S. pastorianus W34/70 je tetraploidní.
Wendland, 2014, Euk. Cell. 13: 1256.
Vybrané senzoricky aktivní látky v pivu
Sloučenina Popis vůně a chuti
Acetátové estery
ethyl acetát ovocná, rozpouštědlo
isoamyl acetát banán, hruška
fenyl ethyl acetát růže, med, sladká
isobutyl acetát ovoce
MCFA etyl estery
ethyl hexanoát (kaproát) jablko, anýz
ethyl octanoát (kaprylát) jablko
etyl dekanoát květiny
etyl nicotinát medicínská, rozpouštědlo, anýz
etyl pyruvát hrášek, čerstvě posekaná tráva
etyl laktát ovoce, máslo
Vyšší alkoholy
propanol alkohol, sladká, rozpouštědlo
izobutanol rozpouštědlo, alkoholová
izoamyl alkohol alkoholová, banán, ovoce
amyl alkohol alkoholová, rozpouštědlo
2-fenyletanol květiny, růže
Fenolické sloučeniny
4-vinylguaiakol hřebíček
Vicinální diketony
diacetyl po másle
pentadion po másle a karamelách
Krogerus a Gibson, 2013, Pires a kol., 2014, Procopio a kol., 2011, Saerens a kol., 2008, Verstrepen a kol., 2003c
Lambic
• střevní bakterie (3 - 7 dní)
• Kloeckera apiculata (3 - 7 dní)
• Saccharomyces (2 týdny)
• bakterie mléčného kvašení (3 - 4 měsíce)
• kvasinky rodu Brettanomyces (8 měsíce)
• kvasinky s oxidativním metabolizmem (8 měsíce)
http://www.lambic.mu/
https://eurekabrewing.wordpress.com/2012/04/29/brettanomyces-lambicus-microscopy-pictures/
Plzeňský typ - Budvar
www.budejovickybudvar.cz
Český ležák
http://pivni.info/minipivovary/531-
minipivovar-novosad-harrachov.html
Fáze přípravy piva
• příprava mladina
• hlavní kvašení
• dokvášení
http://www.pivovarcernahora.cz/pivovar-a-okoli/jak-varime-nase-pivo/
Hlavní kvašení
• dle typu piva
– spodní kvašení 6-12°C
– svrchní kvašení 17-25°C
• zhruba 7 dní (spodní)
(bílé kroužky, hnědé kroužky,
flokulace a sedimentace kvasnic)
3 dny (svrchní)
!!jiný charakter piva pokud tank
„leží“ či „stojí“
Hlavní kvašení – spilka
http://www.protext.cz/english/zprava.php?id=11708
Minipivovar Veselka, Litomyšl
Hlavní kvašení – CK tanky
http://www.brewia.cz/index_4CZ.html
http://www.holidaycheck.cz/fullscreen-
Pivovar+Velk%C3%A9+Popovice+CK+tanky-ch_ub-id_1159333861.html
Hlavní kvašení - flokulace
• reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky,
floky)
• !! na konci hlavního kvašení !!
• usnadňuje filtraci piva
• vliv složení média, genetické výbavy kmene (asi 33 genů), teploty, stavby
a morfologie buňky…
http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-001/hesla/agregace.html
(Verstrepen et al., 2003, upraveno)
FLO geny
(Smukalla et al. 2008, upraveno)
• geny FLO1, FLO5, FLO9, FLO10, FLO11,
Lg-FLO kódují zymolektin
• gen FLO8 je transkripční aktivátor
• umístění blízko telomer
• nestabilní geny
Lektinová hypotéza - flokulace
• interakce lektinového typu
(polysacharid – protein)
• specifická vazba zymolektinu
na povrchu buňky na manózové
zbytky v buněčné stěně
sousední buňky
• ionty Ca2+ jsou přímo zapojeny
v uhlovodíkových vazbách
• (dříve se mělo za to, že udržují správnou
konformaci zymolektinové vazebné sítě)
(Miki et al. 1982, upraveno)
Flokulační fenotyp
• Flo1 – manóza senzitivní
– laboratorní kmeny
• NewFlo – manózo/glukózo senzitivní
– pivovarské kmeny
– širší specifita zymolektinu
– stacionární fáze růstu
(Brauer et al. 2006, DOI 10.1534)
Zrání piva a dokvášení
• dle stupňovitosti a typu piva!!!!! (pšeničné, IPA, Ale, Porter, ležák,…)
• 3 a více týdnů za nízkých teplot (0,5-4°C)
• sycení piva, dotváření chuti
• CK tanky nebo ležácké tanky
• autolýza kvasinek je nežádoucí
pivni.info
http://www.zamberk.cz/Svatkydreva/2009/
Dotváření chuti
ležácký sud, CK tank (svisle, vodorovně)
• diacetyl (typický malý obsah pro česká piva)
• sycení piva CO2
• pšeničná piva
(4-vinyl guaiacol „hřebíček“,
izoamylacetát „banán“, vanilin, atd.)
v pivu bylo objeveno kolem 1000 různých látek, většina je senzoricky aktivní
• silný charakter:
říz (oxid uhličitý – vzniká kvašením)
hořkost (ze chmele nebo chmelových produktů)
alkoholová (alkohol – vzniká kvašením)
• střední charakter: ovocná-esterová, diacetylová, po vyšších alkoholech, sladká, karamelová, DMS
(dimethylsulfid), kyselá,
oxidační, mastné kyseliny atd.
• slabý charakter: velká škála látek; některé z nich mohou být ze střední skupiny, pokud se projevují slabě
Dokvášení
Propagace kvasnic
www.jackzthebrewer.com
Propagace kvasnic
www.destila.cz
Pivovar Ježek
Kvasná mikrobiologie, Tvrdoň a Bálešová,1982
Vícenásobné použití kvasnic
• kvasinky lze po hlavním kvašení tzv. sebrat a použít znovu
(ne do nekonečna) + nové
• kontrola kvasinek – viabilita
• vliv technologických stresů
– teplota, promývání, stupňovitost mladiny, atd.
• rozdíl u typů piv na požadavky !!!
Kontrola kvasinek
• vitální barvení
• acidifikační test
Kontaminace v pivovaru
• bakterie (aerobní i anaerobní)
• kvasinky, které nejsou využívány úmyslně a nejsou plně pod kontrolou
– non-Saccharomyces: Brettanomyces, Candida, Debaryomyces, Dekkera,
Hanseniaspora, Pichia, Rhodotorula, …
omezená schopnost růstu a množení za anaerobních podmínek a zkvašování
cukrů
– Saccharomyces (wild yeast) – těžké odlišení
produkce nežádoucích aromatických látek (fenolické), amylolytické
vlastnosti
– „killer kmeny“ Saccharomyces – toxin; usmrcení původního kulturního
kmene
– RD mutanty Saccharomyces – změny, ztráty či delece mtDNA
Klasifikace kvasinek
z pivovarského prostředí
Rozlišení kvasinek
(kultury na membránových filtrech)
Mikrobiologická „čistota“
Hutzler et al. 2012, EBC Symposium
Non-Saccharomyces kvasinky v pivu
• Pokusy s Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces marxianus a
Hanseniaspora uvarum
– využití cukrů, rezistence ke chmelovým látkám a etanolu, PCR fingerprinting, propagační
testy, metabolizmus aminokyselin, POF, zkušební kvašení (redukce extraktu, pH,
koncentrace buněk ve vznosu, vedlejší produkty)
• Některé kmeny jsou vhodné pro produkci, některé pro pre-fermentaci s
následným kvašením pomocí rodu Saccharomyces, některé nejsou vhodné
pro produkci piva
Michel et al., dosud nepublikováno
Fermentace vína
Vinařské kvasinky
• „čisté kvašení“ kulturními kvasinkami
– S. cerevisiae a S. bayanus
• „spontánní kvašení“
– kvasinky z povrchu bobulí: Kloeckera, Hanseniaspora,
Saccharomyces, Metchnikowa, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces,
Rhodotorula, Cryptococcus, Brettanomyces, Debaryomyces, Pichia,
Candida…
– nízká fermentační aktivita, ale na začátku kvašení dominují
– tolerance jiných mikroorganizmů
– Saccharomyces – schopnost dominovat
Vinařské kvasinky - Saccharomyces
• tolerance k SO2
• kvašení do 25°C po dobu 7-14 dnů
• autolýza kvasinek přispívá k buketu vína
• tolerance k alkoholu (11-14%)
• nízká koncentrace zbytkových cukrů (2-5 g/l)
• produkce žádoucích esterů
• nízká produkce těkavých kyselin
Vinařské kvasinky - Saccharomyces
• nejčastěji diploidní, homozygotní a homotalické
• chromozomové polymorfizmy (rekombinace Ty retrotranspozonů či
subtelomerických oblastí)
• geny PAU: adaptace na stresové podmínky při výrobě vína, jsou
regulovány anaerobními podmínkami
• jiný počet kopií genu než u laboratorních kmenů (převážně geny důležité
pro kvašení: membránové transportéry, metabolizmus etanolu, geny pro
rezistence, atd.)
Spontánní kvašení
• v první fázi dominují kvasinky non-Saccharomyces - hodnoty až 106 – 107
CFU/ml (Kloeckera, Candida, Metschnikowia, Pichia, Brettanomyces,
Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Rhodotorula,
Zygosaccharomyces)
• tyto kvasinky jsou citlivější k alkoholu → následně převládá rod
Saccharomyces
• ovlivňují chuť vína sekundárními metabolity
• populace kvasinek na bobulích a ve vinařském sklepě je značně odlišná!!
Průběh v čase: non-Saccharomyces
kvasinky (NS) a celkový počet kvasinek
(TY);
0 h/⁎ = čas inokulace komerčním
kmenem; (vinařství I, 2006 Merlot).
Zott et al. 2008
víno
kakao
lambic
AAB – octové bakterie
LAB – mléčné bakterie
Vinařské kvasinky non-Saccharomyces
• převážne aerobní: Pichia spp., Debaryomyces spp., Rhodotorula spp., Candida
spp., Cryptococcus albidus
• s nízkou fermentační aktivitou (citronkovitý tvar buňky): Hanseniaspora uvarum
(Kloeckera apiculata), Hanseniaspora guilliermondii (Kloeckera apis),
Hanseniaspora occidentalis (Kloeckera javanica)
• s fermentativním metabolizmem: Kluyveromyces marxianus (Candida kefyr),
Torulaspora delbrueckii (Candida colliculosa), Metschnikowia pulcherrima (Candida
pulcherrima), Zygosaccharomyces bailii
(Jolly et. al. FEMS Yeast Res, 2014)
vliv na aroma vína
terpenoidy, estery (160 esterů detekovaných ve víne), vyšší alkoholy (n-propanol,
isobutanol, isoamyl alkohol, aktivní amyl alkohol;), glycerol, acetaldehyd, etyl acetát,
kyselina octová a jantarová, ß–glukozidásová aktivita (uvolnění těkavých složek z
netěkavych prekurzorů), terpenoly (citronelol, nerol a geraniol)
(Jolly et. al. FEMS Yeast Res, 2014)
Produkce sekundárních metabolitů (mg/l) v syntetickém médiu různými kmeny non-Saccharomyces
(Romano et al. 1997)
Vinařské kvasinky non-Saccharomyces
Vinařské kvasinky non-Saccharomyces
Pichia spp. Debaryomyces spp.
Rhodotorula spp.
Hanseniaspora uvarum
(Kloeckera apiculata)
de.wikipedia.org
http://www.tehnologijahrane.com
http://www.kimchitech.co.kr
http://www.tehnologijahrane.com
http://wineserver.ucdavis.edu
Poměrné zastoupení kvasinek izolovaných z různých vinic a vinařských sklepů
Sabate et al. 2002
Pekařské kvasinky
• stálost technologických vlastností
• aerobní metabolizmus
• aglutinace a autolýza je nežádoucí (trvanlivost)
• cílem je zisk co největší biomasy
(rychlé množení, bez alkoholového kvašení)
Lihovarské kvasinky
• melasové zápary
• vysoká tolerance k alkoholu (až 11%) a teplotě
• vysoká rychlost kvašení 24-48 hod
• osmotolerance (využití koncentrovanějších melas)
• nežádoucí je aglutinace a sedimentace
SCP (Single Cell protein)
• S. cerevisiae - pro potravinářské účely sušení biomasy při vyšších teplotách
→ přísada do polévek, omáček, masných výrobků, …
• pro krmivářské účely se využívá Saccharomyces ojediněle (většinou ke
zkrmení nekvalitního droždí)
• využití i rodu Candida - produkce min. 50% bílkovin v sušině, menší
nároky na výživu a tolerance medií s vyšším obsahem solí
Candida utilis, C. tropicalis, C. pseudotropicalis, C. robusta, C. scottii,
C. ingens, C. crusei, C. mogii, C. boidinii atd.
• vyjímečně i ostatní kvasinkovité mikroorganizmy jako Yarrowia lipolytica,
Hansenula anomala, Hansenula polymorfa, Hansenula capsulata,
“Pichia pastoris“
• SCP (bakterie, kvasinky) obsahuje 70-80% hm. čistých bílkovin
SCP
• melasa – v současné době jen ve výjimečných případech
• lihovarské výpalky, sulfitové výluhy (po výrobě celulózy) nebo
hydrolyzáty dřeva
• „citrolouhy“ (po výrobě kyseliny citrónové)
• syrovátka a další “odpady“ z potravinářské výroby, případně zemědělství
• n-alkany
• etanol, metanol – mohou být připraveny velmi čisté a získané SCP je
nejvyšší kvality
• mikrobní biomasa se vyznačuje vysokým obsahem nukleových kyselin
(především RNA) v korelaci s obsahem bílkovin a pohybuje se v rozmezí
8-15% sušiny. Max. denní dávka pro člověka je 2 g nukleových kyselin,
což odpovídá asi 20 g mikrobiální biomasy
Výroba potravinářské biomasy – SCP
S. cerevisiae
melasa + kukuřičný extrakt (odpad při výrobě
kukuřičného škrobu) + anorganické látky
Saccharomyces cerevisiae
O2
Kvasničné mléko
Kultivace bez tvorby etanolu, jen produkce biomasy
30 – 34oC
odstředění na kontinuálních
deskových centrifugách
kalolis
droždí
zahuštění na
odparkách
rozprašovací
sušárna
suché, neaktivní
droždí
(přídavek do
omáček, polévek,
masných
výrobků)
Kde získat informace?
• Saccharomyces Genome Database
– www.yeastgenome.org
• Gene Ontology Consortium
– www.geneontology.org
– genomové sekvence, ale i funkční informace o genech ve spojení s jejich
aminokyselinovou sekvencí
• odborné knihy a články
• NCTC National Collection of Type Culures (UK)
• NCIB National Collection of Industrial Bacteria (UK)
• DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,(Německo)
• CBS Centraalbureau voor Schimmecultures (Holandsko)
• CCM Česká sbírka mikroorganizmů (Brno)
• RIBM Výzkumný ústav pivovarský a sladařský (Praha)
• CCDM Sbírka mlékařských mikroorganizmů
• NCYC National Collection of Yeast Cultures (UK)
• TUM Hefezentrum, Technische Universität München (Německo)
• nebo např. Pivní obchod OGAR Brno
Kde získat kvasinky?
Identifikace a rozlišení technologických
kvasinek
• často velice problematické!!!
• produkční kmen x kontaminace
• tolerance k teplotám (30 x 37°C)
• mikroskopie, charakter růstu kolonií (pigment, selekční média)
• využití cukrů
• produkce nejrůznějších látek (diacetyl, pentadion, atd.)
Identifikace a rozlišení technologických
kvasinek
• provozní laboratoř analýzu DNA a PCR nedělá
→ spolupráce s výzkumnými ústavy, univerzitami
• PCR a RFLP metody
– ITS region, HIS4 gen, …
• RFLP mtDNA
• Karyotypizace, MALDI-TOF
Multiplex PCR
pro v současné době platné druhy rodu Saccharomyces
• druhově specifické primery (Muir et al., 2011, FEMS Yeast Res:552-563)
M – marker
1 – S. cerevisiaeT
2 - S. bayanusT
3 - S. arboricolaT
4 – S. mikataeT
5 - S. kudriavzeviiT
6 - S. paradoxusT
7 - S. pastorianusT
8 – negativní kontrola
S. eubayanusT (primery dle Pengelly a Wheals, 2013, FEMS Yeast Res:156-161)
Real time PCR (Hutzler, 2010)
• systém pro rozlišení spodních a svrchních pivovarských kvasinek
(UG LRE1; UG 300, OG; OG-Wein)
• identifikace spodních pivovarských kvasinek na základě úseku mtDNA
Tabulka pro real-time PCR