Analytická cytometrie Biofyzikální ústav AVČR Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. IBP-logo Cytometry Publications/Year Data taken from entrez_pubmed Obecný úvod do průtokové cytometrie nZákladní principy, možnosti průtokové cytometrie a její aplikace nHistorie nAplikace –Proliferace –Buněčná smrt Tyto částice mají něco společného … Algae Chromosomes Blood cells Protozoa … určité parametry těchto částic mohou být měřeny pomocí průtokové cytometrie. bd_logo cell signaling cyflowsl Komerční zařízení a vývoj Accuri C6 Flow Cytometer facsariaII_overview influx_image bd_lsr_cell_analyzer lsrii_product facscanto_overview facscalibur_overview image2 CYAN http://www.bioscience.co.uk/userfiles/images/Moxi_Flow_Smaller.png http://www.photonics.com/images2/Website/2011/2011-07/IMS+BIO-FlowCytometry.jpg Co je průtokový cytometr? http://regmed.musc.edu/flowcytometry/images/InterrogationPoint.jpg Co můžeme analyzovat pomocí průtokové cytometrie? nPočítat částice v suspenzi nOddělit živé částice od neživých nHodnotit 10*5 až 10*6 částic za méně než 1 minutu nKvantifikovat rozptyl světla, ale i intenzitu fluorescence nFyzicky separovat jednotlivé částice (populace) pro další analýzu Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 new automatic cell cloning assay (ACCA) for determination of clonogenic capacity of CSCs single cell/well up to 384 well plate re-culture after sorting (2D, 3D) analysis: CyQuant, ATP, xCelligence, microscopy Jaké jsou principy? nRozptyl světla (Light scatter) pomocí laseru nebo UV lampy nDetekce specifické flurescence nHydrodynamicky zaostřený proud částic nElektrostatická separace částic nMožnost multivariační analýzy dat Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Definice nPrůtoková cytometrie (flow cytometry) –Meření vlastností proudících částic (buněk) –také známo jako Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) nPrůtoková separace (flow sorting) –fyzická separace částic (buněk) na základě parametrů měřených průtokovou cytometrií Technické součásti nZdroje světla nDetekční systémy nFluidní systém nSeparace nSběr dat nAnalýza dat J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Technické součásti nDetekční systémy Fotonásobiče (Photomultiplier Tubes (PMTs)) dříve 1-2 nyní 3-8 Diody detekce rozptylu světla (light scatters) nZdroje světla Lasery (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag UV (Arc) Lampy Mercury, Mercury-Xenon J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Stain Your Own Cell Life Technologies Logo Historie barvení biologických materiálů Až do poloviny 19. století – byly používány pouze přírodní barviva Anton van Leeuwenhoek použil v roce 1719 šafrán na obarvení svalových buněk www.euronet.nl/users/warnar/leeuwenhoek.html Historie barvení biologických materiálů Paul Ehrlich - 1879 použil kyselá a zásaditá barviva pro odlišení acidofilních,eosinofilních a neutrofilních leukocytů Clin Lab Med. 1993 Dec;13(4):759-71. The Ehrlich-Chenzinsky-Plehn-Malachowski-Romanowsky-Nocht-Jenner-May-Grunwald-Leishman-Reuter-Wright-Gi emsa-Lillie-Roe-Wilcox stain. The mystery unfolds. Woronzoff-Dashkoff KP. ix70biglightpaths Princip fluorescenčního Mikroskopu - August Köhler - 1904 http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/anatomy.html Historie barvení biologických materiálů Coons et al 1941 – vyvinuli techniku fluorescenčního značení protilátek - označili anti-pneumokokové protilátky pomocí antracénu. To jim umožnilo detekovat protilátky i patogeny v tkáni pomocí UV fluorescence. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group Albert H. Coons, Hugh J. Creech and R. Norman Jones Department of Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, and the Chemical Laboratory, Harvard University Proc. Soc. Exp.Biol.Med. 47:200-202, 1941 “Moreover, when Type II and III organisms were dried on different parts of the same slide, exposed to the conjugate for 30 minutes, washed in saline and distilled water, and mounted in glycerol, individual Type III organisms could be seen with the fluorescence microscope……” Coons a Kaplan (1950) - konjugovali fluorescein s isokyanátem (FITC) – získali lepší signál – dále od autofluorescence. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Friedman n Friedman (1950) – kombinoval kyselý fuchsin, akridinovou žlut´a berberin pro detekci buněk nádorů dělohy pomocí fluorescenčního microskopu 42685 Acid Fuchsin Acid magenta Acid rubin Acid roseine Absorption Max 540-545 P.J. Crossland-Taylor „Sheath Flow“ princip “Provided there is no turbulence, the wide column of particles will then be accelerated to form a narrow column surrounded by fluid of the same refractive index which in turn is enclosed in a tube which will not interfere with observation of its axial content.” J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Wallace Coulter • nWallace Coulter - Coulter orifice - 1956 - n(patent 1953) – měření změny vodivosti během průchodu buněk v suspenzi malým otvorem Originální patentová aplikace W.Coultera 1953 Photo by J.Paul Robinson J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Jak počítat buňky? nHemocytometer (Bürkerova komůrka) byla standardem pro počítání buněk do ~ 1950 nRozměry jsou 3x3x0.1 mm. Obvykle jsou červené krvinky (1 x 106/mm3 )počítány po naředění 1:200 nLeukocyty (5x103/mm3) jsou ředěny 1:10 v roztoku lyzujícím červené krvinky nStatistická chyba: – koeficient variance (CV) je při 500 spočítaných buňkách 4.4% – chyba pipetování a ředění je ~ 10% Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Roche Innovatis Cedex Coulter Counter DSC03890 DSC03891 První komerční verze CC Untitled-7 Coulter Counter © CC Beckman Coulter nMultisizer™ 3&4 COULTER COUNTER® Roche Innovatis CASY TT DSC03898 Cytograph. Stolní přístroj schopný měřit rozptyl světla He-Ne laseru (1970). Mack Fulwyler- sorter n Mack Fulwyler - sorter 1965 - Los Alamos National Labs – jeho sorter separoval částice na základě elektronicky měřeného objemu (stejný princip jako Coulter counter) a separoval pomocí elektrostatického vychýlení. n Cílem bylo sortrovat červené krvinky,protože u nich byla naměřena bimodální distribuce buněčného objemu. Princip separace byl založen na principu inkoustové tiskárny Richarda Sweeta ze Stanfordu (1965) n Po té co bylo objasněno, že bimodalita červených krvinek je artefakt byla tato skupina schopna separovat neutrofily a lymfocyty z krve. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Untitled-6 Richard Sweet n Richard Sweet vyvinul elektrostatickou inkoustovou tiskárnu jejíž princip využil Mack Fulwyler pro svůj buněčný sorter. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 DSC03894 Mack Fulwyler- sorter DSC03895 Mack Fulwyler- sorter K. Souček Leonard Arthur "Len" Herzenberg Klíčové „cytometrické“ publikace n1934: Moldovan – Fotoelektrické meření buněk v kapiláře n1947: Gucker – fotoelektrické počítání buněk n1949: Coultrův počítač částic n1961: Rotman poprvé používá fluorescenci pro kvantifikaci enzymatické reakce n1964: Sweet – elektrostatická inkoustová tiskárna n1965: Fulwyler – květen 1965 - patent elektrostatického sorteru n1965: Kanetsky – spektrofotometrické měření buněk n1965: Fulwyler – listopad 1965 – publikace o buněčné separaci v časopise Science n1968: Gohde – první článek o fluorescenční průtokové cytometrii (v němčině) n1969: Gohde – patent n1969: Van Dilla – druhý článek o fluorescenční průtokové cytometrii n1969: Mullaney – první článek věnující se popisu rozptylu světla jako cytometrického parametru n1969: Heryenberg – třetí článek o fluorescenční průtokové cytometrii n1973: Gohde – patent dvojího značení n1977: Gohde – popis kompenzací signálu při dvojtém značení n1978: Kachel – flow imaging – kombinace průtokové cytometrie a analýzy obrazu n1983: izolace a detekce jader (DNA) z tkání zalitých v parafínu n1984: kongres o nomenklatuře cytometrie DNA n1987: Graz - vysokorychlostní sortrování chromozómů n1991: Robinson – automatizace klinických systémů – průtokový cytometr a čtečka čárkových kódů n n Zdroj – ISAC 2006 –The Wall of History K čemu to všechno je… například… Zackary http://app2.iris.usm.maine.edu/gulfofmaine-censusdev/wp-content/images/Technology/FlowCytobotFigure 02.jpg K čemu to všechno je… například… n n n43 miliónů lidí na světě je infikováno virem HIV (WHO) nročně zemře ~ 2 miliónu lidí na HIV/AIDS (v Africe je ~ 11 miliónu AIDS sirotků) n kvantifikace CD4 T lymfocytů je klíčový parametr při monitorování léčby nPrůtoková cytometrie je „zlatý standard“ nOptimalizované postupy a zařízení pro levné (< 3 EUR / vzorek) a rychlé detekce (250 vzorků / den) nAydogan Ozcan: „Kill the cost, safe live“ n n CyFlow® miniPOC Co tomu předcházelo… nRozvoj techniky umožňující rychlou a reprodukovatelnou detekci cytometrických parametrů. nNové vědecké poznatky vedoucí k definici vhodných diagnostických markerů. [USEMAP] http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/gh/HTML/start.htm?loc=http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/gh/HTML/v ideo/video.html?v=Flowtheinvention.wmv ISAC presents: Mack Fulwyler - Innovator, Inventor & Pioneer [USEMAP] http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto10a/seminalcontributions/fulwyler.html Informační zdroje – průtoková cytometrie nPractical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley-Liss; 4th edition nCytometry: New Developments, Volume 75, Fourth Edition (Methods in Cell Biology), Zbigniew Darzynkiewicz, Academic Press; 4th edition nPrůtoková cytometrie v klinické praxi, T. Eckschlager a kol., Grada 1999 nFlow Cytometry with Plant Cells: Analysis of Genes, Chromosomes and Genomes; Jaroslav Dolezel (Editor), Johann Greilhuber (Editor), Jan Suda (Editor), February 2007 n Více informací o knihách o průtokové cytometrii najdete na: http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/books/bookindx.htm 0471411256 cover_cytometry Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ. ecks_cover Informační zdroje – průtoková cytometrie (metody a protokoly) nThe Handbook of Flow Cytometry Methods nCurrent Protocols in Cytometry Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ. CPC robinson www.cyto.purdue.edu/.../slide0046_image018.jpg Více informací o knihách o průtokové cytometrii najdete na: http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/books/bookindx.htm Informační zdroje – cytometrie (časopisy) nCytometry Part A nhttp://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/33945 n n n n nCytometry Part B: Clinical Cytometry nhttp://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/102019902 Jednotlivá čísla Cytometry Part A (od roku je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ. Cytometry Part A Cytometry Part B: Clinical Cytometry Informační zdroje – (Internet) nPurdue University, Cytometry Labs nhttp://www.cyto.purdue.edu/ nInternational Society for Analytical Cytology nhttp://www.isac-net.org/ nMolecular Probes (Invitrogen) nhttp://probes.invitrogen.com/handbook/ http://www.bu.edu/flow-cytometry/files/2010/09/Picture11.png http://www.abcam.com/ps/CMS/Images/Intracellular%20flow%20cytometry%20summary.jpg Rozptyl světla nHmota rozptyluje světlo vlnových délek které není schopna absorbovat nViditelné spektrum je 350-850 nm proto malé částice a molekuly (< 1/10 l) spíše viditelné světlo rozptylují nPro malé částice byl popsán tzv. Rayleightův rozptyl (scatter) jehož intenzita je ~ stejná všemi směry nRozptyl větších částic charakterizuje tzv. Mieův rozptyl. Jeho množství je větší ve směru v jakém dopadá světlo na ozářenou částici ð na tomto principu je založeno měření velikosti částic pomocí průtokového cytometru n n Shapiro p.106 mie http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/atmos/blusky.html George Gabriel Stokes (1819 – 1903) Anglický fyzik a matematik působící na univerzitě v Cambridge http://www.nndb.com/people/131/000097837/ 1852 – popsal fluorescenci Název vznikl z anglického slova fluospar (fluorit, kazivec = nerost CaF2) - ke svému pozorování použil roztok chininu, jako zdroj světla sluneční paprsky, jako excitační filtr sloužilo tmavě modré okenní sklo a jako emisní filtr byla použita sklenice bílého vína G. C. Stokes „On the Change of Refrangibility of Light“ Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 1852, vol. 142, p. 463.) fluorit4 Stokes K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Princip fluorescence Fluorescence je výsledek tří fázového u jevu některých chemickýc látek - fluorochromů, fluorescenčních barev. Fluorescenční značka (próba) -fluorochrom schopný lokalizace do určitého bilologockého vzorku nebo odpovídat na specifický podnět. Stage 1 : Excitation A photon of energy hvEX is supplied by an external source such as an incandescent lamp or a laser and absorbed by the fluorophore, creating an excited electronic singlet state (S1'). This process distinguishes fluorescence from chemiluminescence, in which the excited state is populated by a chemical reaction. Stage 2 : Excited-State Lifetime The excited state exists for a finite time (typically 1–10 10-9 seconds). During this time, the fluorophore undergoes conformational changes and is also subject to a multitude of possible interactions with its molecular environment. These processes have two important consequences. First, the energy of S1' is partially dissipated, yielding a relaxed singlet excited state (S1) from which fluorescence emission originates. Second, not all the molecules initially excited by absorption (Stage 1) return to the ground state (S0) by fluorescence emission. Other processes such as collisional quenching, fluorescence energy transfer and intersystem crossing (see below) may also depopulate S1. The fluorescence quantum yield, which is the ratio of the number of fluorescence photons emitted (Stage 3) to the number of photons absorbed (Stage 1), is a measure of the relative extent to which these processes occur. Stage 3 : Fluorescence Emission A photon of energy hvEM is emitted, returning the fluorophore to its ground state S0. Due to energy dissipation during the excited-state lifetime, the energy of this photon is lower, and therefore of longer wavelength, than the excitation photon hvEX. The difference in energy or wavelength represented by (hvEX–hvEM) is called the Stokes shift. The Stokes shift is fundamental to the sensitivity of fluorescence techniques because it allows emission photons to be detected against a low background, isolated from excitation photons. In contrast, absorption spectrophotometry requires measurement of transmitted light relative to high incident light levels at the same wavelength. Jablonski diagram illustrating the processes involved in the creation of an excited electronic singlet state by optical absorption and subsequent emission of fluorescence. The labeled stages 1, 2, 3 are referred to in the text. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescenční spektra Fluorescenční proces je cyklický. Kromě fluorochromu nevratně zničeného (photobleaching - „vysvícení“) může být opakovaně excitován. Excitation of a fluorophore at three different wavelengths (EX 1, EX 2, EX 3) does not change the emission profile but does produce variations in fluorescenceemission intensity (EM 1, EM 2, EM 3) that correspond to the amplitude of the excitation spectrum. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Detekce fluorescence Vybavení pro fluorescenci (1) zdroj excitace (2) fluorochrom (3) vlnové filtry pro izolaci emitovaných fotonů od excitovaných (4) detektory pro registraci emitovaných fotonů Fluorescenční přístroje - spektrofluorometer měří průměrné vlastnosti objemu vzorku v kyvetě. - fluorescenční mikroskop popisuje fluorescenci jako jev v prostorovém systému souřadnic - flow cytometer měří fluorescenci v proudícím toku, umožňuje detekovat a kvantivikovat subpopulace uvnitř velkého vzorku Fluorescenční signál - spektrofluorometer je flexibilní, umožňuje měřit v kontinuálním spektru excitačních a emisních vlnových délek - flow cytometr potřebuje fluorescenční značky excitovatelné určitou vlnovou délkou. Fluorescence pozadí - endogení složky - autofluorescence - nenávazané nebo nespecificky vázané značky = reagenční pozadí Vícebarevné značení - dvě a více značek, zároveň monitoruje různé funkce - nutné: vhodně zvolit značky zdroj excitace a separační filtry K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescence Output of Fluorophores Comparing Different Dyes F-actin ~ BODIPY FL phallacidin anti-ß tubulin ~ Texas Red goat anti–mouse IgG DNA ~ DAPI Mouse 3T3 l Hind III propidium iodide K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie BD LSR II system LSRbig DETECTOR LSRoptics [USEMAP] http://jcsmr.anu.edu.au/facslab/facs/LSR2.html http://www.humanarray.com/wp-content/uploads/2012/03/LifeTech-Applied-Bio-Attune-6.jpg Life Technologies Logo Způsoby pro zobrazení dat 4Color TBNK + TruC02 4Color TBNK + TruC02 4Color TBNK + TruC02 4Color TBNK + TruC02 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Vícebarevné analýzy generují mnoho dat… 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 color 4 color 5 color Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Mad Scientist Cartoon upraveno podle J.P.Robinson http://www.chromocyte.com/Library/ResizedImages/445/522/Batch_Analysis.png Cell tracking and proliferation d:\powerpoint\figures\chapter17\1701.jpg figure 8-03a figure 8-03b Approaches nCell cycle analysis nDNA synthesis analysis nCell tracking What is important for sample preparation and staining … nSample processing depends on the particular analysis … –Single cell suspension –Vital stain •diffusion •active transport –fixation (ethanol, formaldehyde) –permeabilization (detergents) Buněčný cyklus [USEMAP] d:\powerpoint\figures\chapter18\1801.jpg d:\powerpoint\figures\chapter17\1716.jpg d:\powerpoint\figures\chapter17\1708.jpg http://i.imgur.com/iq9cbSw.jpg •One of the oldes application of flow cytometry, analysis of the cells in cell cycle phases based on the quantification of DNA •flow cytometry is convenient method for quick and relatively precise determination of cell cycle •DNA is simply labeled using fluorescent dye specific for DNA •Propidium iodide •4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) - fluorescence increases after binding to DNA. Membranes have to be permeabilized. •Hoechst 33342 •Vybrant® DyeCycle™ •DRAQ5 •Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids (QBAs) I. Slaninova, J. Slanina and E. Taborska, "Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids--novel cell permeant and red fluorescing DNA probes," Cytometry A, vol. 71, no. 9, pp. 700-708, 2007. - labeling of live cells (possible cytotoxicity) Cell cycle analysis G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0 G1 s G2 M DNA Analysis DNA content Count 2N 4N Normal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories - propidium iodide - DAPI - Hoechst 33342 - 7-AAD Cell cycle histogram: how to analyze? nIt is not recommended to statistically analyze it using simple gating in the histogram nIt is necessary to use software tolls for modeling of distribution of cell cycle phases http://www.denovosoftware.com/images/basicDnaPlot.png http://www.denovosoftware.com/assets/images/content/webinar_Flow_Ruo_logo_Thumb.png https://lh4.googleusercontent.com/2kpekjne9bxvZF0UTC6QQszo-zdRB4hRcM1gOEFr2HKWczwpVaQyPTzQO4kPXwLDA -6auqRYnyVYW8EnTLI9ssPDIUD-Cye4AGZaCFL77oq-ln7zAP346Ype http://flowjo.com/wp-content/uploads/2013/11/FJCOMBOTEST3.png logo Analysis of synchronized cells Analysis if BrdU incorporation nBromodeoxyuridin (BrdU) is incorporated into DNA instead of thymidine during S-phase nBrdU is detected using specific antibody after the fixation and partial denaturation of DNA (acid, DNAse) nDNA can be stained in the last step Analysis if BrdU incorporation Click azide/alkyne reaction http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/images/ics_organized/applications/cell_tissue_analysis/da ta_diagram/750_wide.Par.94243.Image.-1.-1.1.gif Invitrogen Aplikace Click-IT (Invitrogen) Multiplex imaging with Click-iT® RNA assays. NIH3T3 cells were incubated with 1 mM EU, formaldehyde-fixed, and permeabilized with Triton® X-100. EU incorporated into newly synthesized RNA (red) in some cells was detectied using the Click-iT® RNA Alexa Fluor® 594 Imaging Kit. Tubulin (green) was detected with anti-tubulin mouse IgG9 and visualized with Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG. Nuclei (blue) were stained with Hoechst 33342. Click-IT (Invitrogen) applications analysis of DNA synthesis (EdU - 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) 02ClickiTAnim01 Tritiated (3H) thymidine 3H-thymidine 02ClickiTAnim01 • Original method for measuring cell proliferation • Radioactive • Not compatible for multiplexed analyses 3H-thymidine 02ClickiTAnim01 BrdU03 BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) BrdU Br Br Br Br 02ClickiTAnim01 Br Br Br Br BrdU 02ClickiTAnim01missing 02ClickiTAnim01 Br Br Br Br BrdU 02ClickiTAnim01missing Br Br Br Br BrdU 02ClickiTAnim01missing Br Br Br Br BrdU • Non-radioactive • Multiplex compatible but, strand separation requirement for anti-BrdU access, can affect: • Ability for other antibodies to bind • Morphology • Ability for dyes that require dsDNA to bind efficiently, i.e., cell cycle dyes EduBlack01 02ClickiTAnim01 EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) Click-iT™ EdU 02ClickiTAnim01 Click-iT™ EdU FluorBefore01 FluorAfter01 FluorBefore01 FluorAfter01 FluorBefore01 FluorAfter01 FluorBefore01 FluorAfter01 02ClickiTAnim01 Click-iT™ Edu FluorAfter01 FluorAfter01 FluorAfter01 FluorAfter01 • Non-radioactive • No DNA denaturation required • Simplified protocol • Small molecule detection • Multiplex compatible, including • Other antibodies • Dyes for cell cycle analysis Click-iT™ EdU - limitations Intracellular protein detections in combinations with DNA analysis Detection of mitotic cells nHistone H3 is specifically phosphorylated (Ser10, Ser28, Thr11) nDouble stain of DNA and H3-P identifies populations of the cells in M-phase http://www.cellsignal.com/products/images/3465_ific_jp_090213.jpg http://www.cellsignal.com/common/cellsignaling.gif Tracking of cell division nNonspecific labeling of cellular proteins using carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE or CFSE, CellTrace™ Violet, CellTrace™ Far Red DDAO-SEt) n Tracking of cell division http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/en/images/ics-organized/applications /cell-tissue-analysis/data-chart/180-wide.par.32782.image.-1.-1.1.gif http://www.appliedbiosystems.com/etc/medialib/appliedbio-media-library/images/application-and-techn ology/flow-cytometry/data-images.Par.85351.Image.gif?direct=1 Applied Biosystems [USEMAP] http://www.stanford.edu/group/nolan/ Garry Nolan Peter Krutzik „Fluorescent cell barcoding“ Fig 1 full size Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie > Fig 3 full size Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie The Nobel Prize in Chemistry 2008 n"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" Nobel Prize® medal - registered trademark of the Nobel Foundation http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ Fluorescent proteins nbioluminescence resonance energy transfer (BRET) –Aequorea victoria - jellyfish –Blue bioluminescence. Ca2+ interacts with aequorin photoprotein. –Blue light excites green fluorescent protein. –Renilla reniformis – coral –luminescence appears after degradation of coelenterazine in the presence of luciferase enzyme. –Blue light excites green fluorescent protein – – Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescent proteins n Osamu Shimomura –1961 discovered GFP and aequorin n http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm nScience. 1994 Feb 11;263(5148): nGreen fluorescent protein as a marker for gene expression. nChalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. n nDepartment of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY 10027. n n A complementary DNA for the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) produces a fluorescent product when expressed in prokaryotic (Escherichia coli) or eukaryotic (Caenorhabditis elegans) cells. Because exogenous substrates and cofactors are not required for this fluorescence, GFP expression can be used to monitor gene expression and protein localization in living organisms. Fluorescent proteins nDouglas Prasher nMartin Chalfie mice_400x300 [USEMAP] Fluorescent proteins http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm Roger Tsien n~ 2002 – mutated FP = wide spectrum of colors nhttp://www.tsienlab.ucsd.edu/ http://www.tsienlab.ucsd.edu/HTML/Images/IMAGE%20-%20PLATE%20-%20Beach.jpg The image “http://www.tsienlab.ucsd.edu/HTML/Images/IMAGE%20-%20Rendered%20GFP%20-%20640.jpg” cannot be displayed, because it contains errors. Roger Y. Tsien Analysis of synchronized cells Fucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) cells Nature Methods - 5, 283 (2008) Ubiquitin E3 ligase complexes G1 - APCCdh1 S, G2, M- SCFSkp2 http://www.amalgaam.co.jp/products/advanced/img/fucci/E3.jpg Fucci http://cfds.brain.riken.jp/Fucci.html Summary nDNA analysis –Require fine sample preparation, debris elimination, sw tool for precise analysis of histograms –It is possible to combine with analysis of other parameters e.g. DNA synthesis nCell division enumeration –Mostly for synchronized populations nFluorescent proteins –Fucci – elegant tool for in vitro a in vivo experiments n Detection of cell death Viability detection nSimple analysis nprinciple –Detection of plasmatic membrane integrity using fluorescent probes – propidium iodide, ethidium bromide, 7-amino actinomycin D •Only dead cells are positive – –Detection of physiological function of the cells (enzymatic activity) –Rhodamine-123, Calcein-AM •Only live cells are positive • nHow to stain dead cell and fix&perm it afterwards? –ethidium monoazide –Pomocí LDS-751 (laser dye styryl-751) je možné odlišit mrtvé buňky i po fixaci –LIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain Kits, Zombie Dyes™ n http://www.biolegend.com/media_assets/common/biologo3.png http://gallery.mailchimp.com/caa353593e76589fbf07abdc4/images/zombie6ff100.png Viability detection Propidium Iodide LIVE/DEAD Far Red Apoptosis - Programmed cell death - described by J. F. Kerr in 1972 to differentiate it from necrosis - genetically controlled, complex process, directed self-destruction of the cell - important for homeostasis Apoptóza Morphology – necrosis vs. apoptosis nLoss of integrity of cytoplasmic membrane nSwelling of cytoplasm, increase of cell volume nDesintegration of nucleus and other organelles nLysis of the cell n nSwelling of cytoplasm without loss of cell integrity nCell shrinkage nCondensation of the nucleus and specific chromatin fragmentation nSustained organelle integrity nFormation of apoptotic bodies n slide007 Nekróza Apoptóza > > Biochemistry – necrosis vs. apoptosis nWithout specific molecular control nPassive process without energy (ATP) nUncontrolled nuclear DNA destruction nWithout role of mitochondria nLoss of ion balance control n n nActivation of specific signaling pathways – caspases, nucleases nEnergy (ATP) consumption nSpecific fragmentation of DNA nRelease of regulatory molecules from mitochondria nChanges in symmetry of lipid membranes Physiological role– necrosis vs. apoptosis nAffects cell populations nInduced by non-physiological stimuli nDestruction of surrounding tissue – release of toxic compounds nInduces inflammation nAffects single cells nInduces via physiological stimuli nphagocytosis nWithoutt presence of inflammation General hallmarks of apoptosis nCharacteristics of cellular membranes nCharacteristics of nucleus nDetection of specific genes and proteins regulating apoptosis Regulation of apoptosis Characteristics of membranes nPlasmatic membrane –Integrity of plasmatic membrane –Important changes in symetry •Externalization of phosphatidilserines (PS) – „eat me“ signal for phagocytes •Annexin V – high affinity to PS – sensitive probe for asymmetric membrane extracellular cytoplasmic extracellular cytoplasmic phosphatidyl- serine Annexin V- conjugate normal cell apoptotic cell extracellular cytoplasmic necrotic cell PI PI PI annexin V propidium iodide staining - - + - + + Annexin V staining: phosphatidylserine exposure Annexin V/PI assay www-abdserotec.com 5 % 26 % Importance of timing (apoptosis, necrosis, secondary necrosis) A. Hyršlová Vaculová Detection of PS translocation •Pros – specific marker, relative early – possible to combine with other vital markers e.g. CD antigens – •Cons –Necessary to label already dead cells –Optimization of the protocol for particular cell type –Measurement has to be done quickly –Not possible to analyzed in fixed cells Characteristics of membranes nMitochondrial membranes –Changes in outer mitochondrial membrane permeability –Changes in mitochondrial membrane potential DYm –Release of apoptosis mediator form mitochondrial intermembrane space into cytoplasm Baliga B., Kumar S. (2003) Cell Death Differ. 10: 16-18 Desagher S., Martinou J. C. (2000) Trends Cell Biol. 10: 369-377 Van Loo G., et al. (2002) Cell Death Differ. 9: 1031-1042 Death signal convergence onto mitochondria Mitochondria a DYm Dp = DYm - 60 DpH Dp ~ electrochemical proton gradient (180mV) DYm ~ mitochondrial membrane potential (MMP) (150mV) DpH ~ pH gradient + - + - + - + - + - + - Alberts, B., et. al. (2002), Molecular Biol. of the Cell Dp drives ATP-ADP transport, import mitochondrial proteins and transport of metabolites Mitochondria, DYm and apoptosis Depolarization of mitochondrial membrane and DYm loss can be consequence of „permeability transition pores“ (PTP) or loss of integrity of outer mitochondrial membrane Depolarization of mitochondria is associated with: • ischemia/reperfusion • oxidative stress • cell death • Mitochondria, DYm and apoptosis Desagher S., Martinou J. C. (2000) Trends Cell Biol. 10: 369-377. VADC ~ voltage-dependent anion chanel ANT ~ adenine-nucleotide translocator Dym detection •electrodes •Radioactive probes •Lipophilic fluorescent cation Cossarizza, A. (1998), Purdue Cytometry CD-ROM Volume 3 Fluorescent probes for DYm analysis DYm detection JC-1 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide ex./em. = 514/529 nm, monomer form; 585/590 nm J-aggregate form TMRE ex./em. = 551/576 nm tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate NIH 3T3 Possible combination of DYm analysis and other parameters Vital staining • §CD antigens (TMRE, CMXRos/anti-CD Ab-FITC) § PS translocation (TMRE, CMXRos/Annexin V-FITC) §ROS productions (TMRE/DHR-123) §Ca2+ (TMRE/Fluo-3 ) §viability (propidium iodide, 7-AAD) §fluorescent proteins (TMRE/GFP) Detection [Ca2+]i and DYm Fluo-3 AM/TMRE (HL-60/DMSO/120 h) Detection of ROS and DYm DHR-123/TMRE Human promyelocytes HL-60 Valinomycin (100 mM) NDGA (20 mM) Analysis of MMP •Pros –Simple, easy, relatively low cost –Good separation between pos and neg populations –Possible to combine with other vital analyses – •Cons –Specificity has to be confirmed using different method –Not always specific –Optimization of probe concentration – Changes at nucleus nCondensation and fragmentation of nuclear chromatin nCharacteristic morphology nAnalysis of DNA fragmentation –sub G0/G1 population –TUNEL G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0 G1 s G2 M DNA Analysis DNA content Count 2N 4N Normal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories - propidium iodide - DAPI - Hoechst 33342 - 7-AAD subG0 G1 Analysis of subG0/G1 population Analysis of subG0/G1 population - extraction of low molecular weight fragments of DNA using citrate buffer Analysis of subG0/G1 population npros –Quick and cheap –Analysis together with cell cycle detection –Flexible regarding DNA labeling ncons –Limited specificity– size of subG0 population is overestimated, please NEVER use log scale –Detectable also in mechanically destroyed cells –Cells dying in G2 phase is difficult to detect Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling - TUNEL nDNA breaks detection n3´-OH ends of single or double strand breaks are labeled by modified base analogue using deoxynucleotidyl transferase nvizualization –direct (FITC-dUTP) –indirect (AP, POD, anti-BrdU Ab) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie TUNEL TUNEL npros –sensitive, specific –Possible to combine with cell cycle detection – ncons –Costly and time consuming –Large number of cells –Some fixation procedures generate artifacts – http://www.ihcworld.com/imagegallery/albums/userpics/10003/tunel.jpg What method we should use? nalways use more then one method; nrecommended to combine methods of different principles; nconsider your experimental model (cell type and design) - „time window“of each method is different What else we should consider…? neach method will give you different numbers (it is reality) - always specify methods you used nkinetics and turnover of dying cell subpopulation is important nthere is more types of cell death, even in your tissue culture dish nin vitro and in vivo situation is really different Biologické aplikace průtokové cytometrie nCytogenetika –analýza chromozómů •karyotyp •sortrování –chromozómové DNA knihovny –FISH značení (chromosome painting) • K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Analýza a sortrování chromozómů Analýza a sortrování chromozómů nsynchronizace buněk – zisk metafázních chromozómů (colcemid, hydroxyurea) nizolace chromozómů nznačení DAPI nebo Hoechst vs. chromomycin A3 (CA3) nebo mithramycin n= celková DNA vs. G/C-bohaté oblasti n NCBI PubChem logo http://www.scienceclarified.com/Ca-Ch/Chromosome.html http://www.nccr-oncology.ch/scripts/page9243.html Analýza a sortrování chromozómů „Flow karyotype“ http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/ ♂ ♀ Karcinom močového měchýře Sortrování chromozómů Pisum sativum Sortrování chromozómů Vicia faba Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nekologie npotravinářství nbioterorismus http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/ Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nviabilita nmetabolické funkce nsortrování n Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nSortrování –EPICS + Autoclone® modul n Průtoková cytometrie kvasinek nbuněčné dělení nviabilita nmembránový potenciál nrespirace nprodukce H2O2 ncitlivost k antibiotikům nseparace n Saccharomyces cerevisiae http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Budding_yeast_Lifecycle.png http://www.sbs.utexas.edu/mycology/sza_images_SEM.htm Průtoková cytometrie kvasinek Průtoková cytometrie v hydrobiologii nstudium pico- a nano-fytoplanktonu (< 20 mM) nanalýza metabolických funkcí planktonu nstudium pigmentace (analýza chlorofylu a fykoeritrinu) Průtoková cytometrie v hydrobiologii Průtoková cytometrie v hydrobiologii nanalýza DNA http://planktonnet.awi.de/portal.php?pagetitle=assetfactsheet&asset_id=15127 http://www.soes.soton.ac.uk/staff/tt/ [USEMAP] Průtoková cytometrie v hydrobiologii http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/sieracki/sierack2.htm Absorption Spectrum Emission Spectrum http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/chlorophyll-a(MeOH).html Průtoková cytometrie bezobratlých nlze aplikovat běžné metodické přístupy a fluorescenční značky n nPříklady aplikací: –buněčný cyklus –cytotoxicita –apoptóza Long Tongue Tachinid Fly 240px-Miesmuscheln_Mytilus_2 Trendy: instrumentace Spectral flow cytometry SP6800 Optical Bench Flowcell Chip with Laser Spots Conventional vs. spectral analysis Standard Comp vs SP6800 Spectral Comp > Single Cell Mass Cytometry http://reports.cytobank.org/105/v2/images/image_1.stream Cells were covalently labeled with a bifunctional compound, maleimido-mono-amide-DOTA (mDOTA). This compound can be loaded with a lanthanide(III) isotope ion, and reacts covalently with cellular thiol groups through the maleimide moiety. Single Cell Mass Cytometry http://reports.cytobank.org/105/v2/images/image_2.stream Seven unique lanthanide isotopes were used to generate 128 combinations, enough to barcode each sample in a 96-well plate. The seven lanthanide isotopes, their masses and their locations on the 96-well plate are shown. Personální systémy CytoFlex - Features & Flexibilities Trendy: Reagencie PrimeFlow™ RNA Assay PrimeFlow™ RNA Assay Workflow Briliant Violet polymers labelsNewHor violet_flow_image flow_cytometry_diagram2 Shrnutí přednášky nprůtoková cytometrie: nnabízí široké spektrum aplikací; nrychlý způsob analýzy a separace heterogenních populací; nseparace populací; nmultiparametrové analýzy n n n