Cvičení k předmětu Bi5580 Obecná ekotoxikologie Nutné potřeby, které studenti přinesou s sebou do cvičení: - Tento návod - Poznámkový sešit, psací potřeby - Nůžky - Pravítko (s milimetrovým rozlišením) - Přezůvky Úvodní přípravné otázky: (zdroj informací pro odpovědi - materiály k přednáškám, www.google.com) - Jaký je význam použitého organismu (= modelový zástupce rostlin)? - Jaké jsou praktické (ekologické) důsledky eventuálního poškození klíčení rostlin ? - Co to je IC50 a co to je IC99 ? Proč se používá právě IC50 a ne například IC99 ? Úloha - Stanovení ekotoxicity v testu klíčení rostlin Úvod: Ve skleněných petriho miskách jsou semena hořčice seté umístěna na filtrační papír a exponována 5 mL standardního média s různým ředěním testované látky. Jako negativní kontrola slouží varianta se semeny exponovanými jen čistým médiem. Po ukončení experimentu se stanoví počet vyklíčených semen v kontrolách a v jednotlivých ředěních a u vyklíčených jedinců se vyhodnotí celková délka kořene. Získané výsledky lze využít pro výpočet hodnot IC50 (koncentrace zabraňující vyklíčení u 50% semen, resp. koncentrace 50% inhibující růst kořene). Metodika testu klíčení je standardizována do podoby Guidline OECD (No. 208) a metodického pokynu MŽP ČR pro hodnocení toxicity odpadů a vodných výluhů (Test inhibice růstu kořene Sinapis alba, Vyhl. MŽP ČR 338/1997). Ve standardní podobě se provádí 4 dny (96 hodin). Pro účely cvičení může byla doba expozice modifikována na 72hodin. Materiál a chemikálie - semena hořčice bílé Sinapis alba (s atestem testu klíčivosti) – 30 min dopředu ponořené v destilované vodě - skleněné petriho misky o průměru 10 cm, pipety 5 a 10 mL, automatické mikropipety, filtrační papír, vialky pro přípravu ředění testované látky, pinzeta, laboratorní plastiková folie, špičky k pipetám - zásobní roztok standardního kultivačního média Tab. 1: Zásobní roztoky solí pro testy na semenech hořčice bílé Zásobní roztok Chemikálie Koncentrace v zásobním roztoku[g·l- 1 ] Roztok 1 CaCl2·2H2O 117,6 Roztok 2 MgSO4·7H2O 49,3 Roztok 3 NaHCO3 25,9 Roztok 4 KCl 2,3 Příprava média : napipetovat 5 ml každého roztoku a doplnit do 1 l destilovanou vodou. Případně upravit pH na 7,6-8. Postup 1 - příprava EXPOZICE: 1) Petriho misky popište jménem, datem , koncentrací testované látky. Do takto připravených petriho misek připravte a vložte kruhové výseče z filtračního papíru. Test bude proveden v duplikátech celkem připravte 8 petriho misek (2x kontrola + 2x 3 ředění vzorku A). 2) Příprava ředění vzorku - připravte následující koncentrace dodaného testovaného vzorku (vzorek A): 0.25% v/v, 0.5% v/v, 1% v/v (do 15 mL standardního média napipetujete potřebný objem testovaného vzorku – 37µL, 75 µL, 150 µL/ 15 mL - změnu celkového objemu zanedbejte) - ředění proveďte v dodaném standardním médiu (roztok solí a základních živin nutných pro klíčení rostlin). 3) Připravené expoziční roztoky dávkujte do petriho misek - vždy 5 mL / misku - u kontrol použijte 5 mL standardního média bez vzorku - použijte jednu pipetu a postupujte od nejnižší po nejvyšší koncentraci 4) Do každé misky vložte 5 semen hořčice bílé 5) Petriho misky překryjte potravinovou folií (zajistí cirkulaci vzduchu a omezí vypařování) a umístěte do temna do inkubační místnosti (pokojová teplota) Postup 2 - vyhodnocení KLÍČENÍ: 1) Po ukončení expozice spočítejte počty nevyklíčených semen na jednotlivých miskách a zapište do tabulky. 2) U vyklíčených semen vyhodnoťte délku kořene (s přesností na milimetry) a zapište do tabulky; 3) Vypočítejte průměrnou hodnotu u každé varianty a hodnoty vyjádřete jako % kontroly a % inhibice (vyjádřete jako celá čísla) 4) Vyhodnocení IC50 proveďte pomocí lineární regrese se zahrnutím logaritmu koncentrace (Excel) 5) Schéma protokolu: princip, postup, výsledková tabulka, grafy pro jednotlivé sledované parametry a závěry PROTOKOL - Cvičení z Obecné ekotoxikologie TEST EKOTOXICITY KLÍČENÍ ROSTLIN: Jména operátorů Datum založení expozice: Datum hodnocení: -> délka expozice (počet dní): Testovaný vzorek (koncentrace % v/v) Rostlina číslo Kontrola 0,25% 0,5% 1% Pozn. Celkem semen 10 10 10 10 Počet nevyklíčených Délky kořenů - Miska A 1 2 3 4 5 Délky kořenů - Miska B 1 2 3 4 5 Průměr délky kořenů % kontroly 100 % inhibice 0 IC50 - klíčení (% v/v) IC50 - růst kořene (% v/v) Otázky: 1) Který z hodnocených parametrů je citlivějším ukazatelem toxicity? 2) Jaké množství testované látky způsobí inhibici růstu kořene o 99% ? Je tento výsledek věrohodný?