•Stanovení bílkovin dle Bradfordové a stanovení sušiny •1) 24 hod. kulturu zcentrifugujeme a 2x promyjeme fosfátovým pufrem •2)Standardy – bílkoviny •10.000μg/ml •1000μg/ml •3ml + 27 ml pufru •1ml bilk.+4ml p. 2+3 3+2 4+1 5 img235 640px-Erlenmeyer_flask_hg ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI •200μg/ml 400 600 800 1000 ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI •3) Měření Genesys ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI •5 ml Coomassie Brilliant Blue G250 •0,1 ml pufr pufr •0,1ml ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI •Měření vlastního vzorku •po změření kalibrační přímky •5ml C.B.Blue + 0,1ml vzorku (90% zákal) •- do pozice 2. (1. původní blank) !!!! •Příprava vzorků pro měření sušiny •a koncentrace bílkovin • - resuspendovat promytou kulturu • v malém množství (několika ml) f. pufru - cca polovinu odlít do erlenky a ředit • na zákal: • 95% - sušina (T=5) • 90% - bílkoviny • 85% - sušina • 75% - sušina •Přesnou hodnotu zapíši!!! •Měřím na Spekolu 11 při 620 nm • •Ze vzorků na určení sušiny pipetuji •PŘESNĚ 2 ml do předem zvážených •váženek (+pufr)– dám do sušárny 106oC •- po 24 h váženky přijít zvážit!!!!! •Porovnat kultury (obsah bílkovin na sušinu), •určit vztah mezi zákalem a sušinou •Kalibrační •přímka • •sušina, bílkoviny • •0,1 ml H2O • •200µg/ml • •Měření při 595 nm • • • • • •Po mineralizaci organické dusíkaté látky varem s koncentrovanou kyselinou sírovou a peroxidem vodíku se dusík přítomný ve formě různých funkčních skupin převede na amoniak, který zůstane vázán ve formě síranu amonného, alkalizací se ze síranu uvolní a stanoví se titračně •Kjeldalova metoda •CH2NH2COOH + 3 H2SO4 ---› 2 CO2 + 4 H2O + NH3 + 3 SO2 •2 NH3 + H2SO4 ---› (NH4)2SO4 •NH4)2SO4 + 2 NaOH ---› 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O •Vytěsněný amoniak je jímán v předloze do známého množství 0,05 M H2SO4 •2 NH3 + H2SO4 ---› (NH4)2SO4 •Titruje se nezreagovaný zbytek odměrného roztoku kyseliny sírové odměrným roztokem 0,1 M NaOH do slabě cibulového zabarvení Kjeldahl digestion Kjeldahl distillation KjelROC Analyzer Současné metody stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Velmi důležitá analýza bez drahých instrumentů Dnes se preferují spektrofotometrické metody Biuretová metoda reakce peptidové vazby s Cu(II) v alkalickém prostředí Tvoří se modrofialové zbarvení, λmax = 540 nm Činidlo obsahuje CuSO4, vínan sodno-draselný a NaOH Metoda nezávisí na aminokyselinovém složení je málo citlivá (cca 10 - 100 mg/mL) Ruší např. NH4+, Tris •Kalibrace na standardy sérový albumin, ovalbumin •Lowryho metoda Lowryho metoda mnohem více závisí na složení proteinu. K reakci peptidové vazby s Cu2+ přispívá redukce fosfomolybdenanů a fosfowolframanů tyrosinem (ale i tryptofanem a cysteinem). Principem je nejprve provedení biuretové reakce a pak přídavek Folinova činidla (fenlové činidlo) Měří se při 650 – 750 nm Vyšší citlivost než biuretová reakce (2-100 mg/ml) Zbarvení není v čase stabilní Ruší např. NH4+ •Kalibrace na standardy sérový albumin, ovalbumin •BCA metoda; od 1985, citlivost 0, 5 mg/ml, • využívá sodné soli kyseliny bicinchoninové (BCA), která komplexuje ionty Cu(I) tvořené reakcí peptidové vazby s Cu(II). Činidlo se připravuje smísením roztoků sodné soli BCA v alkalickém prostředí (100 dílů) a CuSO4 (1 díl) • Měří se při 562 nm •Citlivost na úrovni Lowryho metody • mmenší interference (NH4+ ano) • Kalibrace na standardy sérový albumin, ovalbumin • BCA (Bicinchoninic Acid) Reaction scheme •Stupeň 1 •Stupeň 2 Metoda Bradfordové (5 min), principem je adsorpční vazba barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 na molekulu proteinu Citlivost 1 mg/ml Závisí na obsahu bazických (zvl. Arg), ale i aromatických aminokyselin Množství látek však interferuje, negativně zejména detergenty (SDS, Triton) Nedává tedy tak spolehlivé výsledky jako obdobně citlivá BCA metoda, kde tyto látky neruší Citlivost je 5 x vyšší než u Lowyho metody, lineární kalibrace max. po 20 mg proteinu. Linearita 125 -1 500μg Činidlo (vodný roztok) obsahuje barvivo, etanol a H3PO4. Barva hnědá, po reakci s proteinem intenzivně modrá, λmax = 595 nm CoomassieScheme •Pozor •Barví skleněné a křemíkové kyvety !! Přímá spektrofotometrická stanovení (UV oblast) díky přítomnosti chromoforů v molekulách proteinů, které absorbují v UV oblasti spektra Velkou výhodou je, že jde o nedestruktivní metodu. Pracuje se s křemennými kyvetami, nikoli sklo ani plast V blízké UV oblasti (280 nm) není velká citlivost – 50 mg / mL, v daleké UV oblasti (205 nm) pak dochází ke značné interferenci Samozřejmě je zde velká závislost na aminokyselinovém složení proteinu. Vzhledem k tomu, že UV absorpce je dána aromatickými AK (hlavně Trp a Tyr), je nutná jejich přítomnost Interference širokého absorpčního pásu nukleových kyselin (λmax= 260 nm) se eliminuje měřením při dvou vlnových délkách a početní korekcí. V daleké UV oblasti se využívá vlnová délka 205 nm (maximum absorpce peptidové vazby je při 192 nm). •Vlnová délka (nm) Fluorescenční stanovení fluorimetrické stanovení proteinů je založeno na reakci primárních aminoskupin v proteinu (Lys, N-koncová aminoskupina) s o-ftalaldehydem Citlivost metody může být zvýšena hydrolýzou proteinů před měřením Ruší pufry s obsahem primárních aminoskupin (Tris), nejlépe použít borátový pufr (pH 10.4) Měří se po přídavku hydroxidu sodného excitační vlnová délka 340 nm emise mezi 440 a 455 nm Každý vzorek se měří pouze jednou, ozáření snižuje intenzitu fluorescence. Výsledek obrázku pro o-ftalaldehyd C:\Users\Uživatel\Desktop\NEMEC\Disk C\Dokumenty\Skripta fyziol\Podklady\CvFyz 6.jpg • • • • • • • • • • •0,1 ml •10-1 •-2 •-3 •-4 •-5 •-6 •-7 •-8 • Výsledek obrázku pro erlenmeyerova baňka • •0,2 ml • •kultivace 12h při 37oC - staticky •Počet buněk po n-tém dělení (n generace) • xn = 2n . X0 •V čase t potom • t = nT, kde •n – počet zdvojení za dobu t-t0, T doba potřebná k rozdělení buňky •Dosadíme-li za n=t/T do rovnice • xn = 2n . x0 •Bude se počet buněk v závislosti na čase rovnat • x = x021/T •Počet generací n v čase lze vypočíst i použitím dekadických logaritmů •log x = log x0 + n log 2 •Průměrná rychlost dělení – R (n se vztáhne na dobu růstu populace) •střední generační doba •specifická růstová rychlost μ •(růstová rychlost přepočtená na jednu buňku nebo biomasu ) •doba lagu L •L = tk - te •tk - doba trvání experimentu (experimentálně zjištěná) • •24h kultura •2x promýt ve fosfátovém pufru • •Naředit (fosf. pufr) na zákal 90% (T=10) • • • • • ENDO a EXOgenní aktivita ENDOgenní aktivita • 0,5 ml buněk po dvou zkumavkách 0,5 ml buněk • 0,15 ml fosf. pufru (2 opakování) 0,4 ml fosf. pufru • 0,25 ml substrátu (2) • • startuji reakci přidáním 0,1 ml TTC • • inkubace při 37oC: 0,10,20,30,40,50‘ • • zastavení reakce přidáním 2,5 ml 96% etanolu • • protřepat, centrifugovat – supernatant do čistých zkumavek • • měřím na Spekolu 20 (A485) •Stanovení dehydrogenázové aktivity bakteriálních buněk •Dvojice si rozeberou testované mikroorganismy. •Pro každý pak dělám VŽDY glukózu + další substrát – pro ENDO a EXOgenní aktivitu •plus bez substrátu pro ENDOgenní aktivitu - tedy dohromady 36 zkumavek •Reakce je citlivá na světlo –zakrývat alobalem •Křivka pro EXO a ENDOgenní aktivitu (ug formazabu/mg suš.), dehydrogenázová jednotka pro daný substrát •Odběr na určení sušiny •(2x buňky, 2x pufr – 4ml) •Přikrýt Al folií Redoxreaktion des NAD. •Přirozené akceptory vodíku a elektronů • •Nejčastěji se používají koenzymové formy dehydrogenáz NAD a FAD •Spektrofotometricky se měří jedna forma • oxidovaná – úbytek • redukovaná - přírůstek https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/08/NAD-NADH-Absorptionskurven.svg/364px-NAD- NADH-Absorptionskurven.svg.png https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/5d/FAD_FADH2_equlibrium.png/1920px-FAD_FADH2 _equlibrium.png https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/ee/Flavin_Adenine_Dinucleotide_Spectrum.png •Umělé akceptory vodíku a elektronů • •Jsou charakteristické přechodem z leukoformy na barevnou (nebo naopak) po připojení vodíku. Měření se provádí fotometricky •Metylenová modř •Většinou pro orientační testy nebo při Thumbergově metodě stanovaní dehydrogenační aktivity. Metoda je založena na stanovení rychlosti odbarvování roztoku MM v přítomnosti donoru vodíku •Nevýhoda • musí se pracovat v anaerobních podmínkách • rychlá autooxidace • velká toxicita MM • http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/structure0/012/mfcd00011923.eps/_jcr_content/ renditions/mfcd00011923-large.png •Fenazinmetosulfát •Je výborným akceptorem pro některé dehydrogenázy (laktát-, glycerol fosfát, NADH aj.) •Používá se především při manometrických metodách •Nevýhoda • musí se pracovat v anaerobních podmínkách • rychlá autooxidace • neezymově redukuje cytochrom c, tetrazoliové soli • •Tetrazoliové sloučeníny • •Se velmi často používají jako chlorid nebo bromid pro tzv. TTC test pro stanovení metabolické aktivity – dehydrogenázové aktivity – pro jejich malou toxicitu •TTC je bezbarvý, redukovaný červený (formazan) •Reakce se zastavuje přidáním kyseliny octové, trichloroctové nebo organickými rozpouštědly (aceton, etanol, metanol) • •Nevýhoda • citlivost na přímé světlo • Ttc.PNG •TTC •formazan •Inaktivace fága teplem •Fágový lyzát 812 • • •0,05 ml do 5 ml •vytemperovaného •trisHClpufru (pH=7,2) • •Promíchat a odebrat vzorek •(cca 0,5 ml – čas t=0) • • •Temperovat při 45,50,55,60oC • • •Odběr vzorků 10,20,30,40,60 min • • •výsev vhodného ředění na misky •přelít 0,7% agarem s S. aureus SA812 •S CaCl2 čas 45oC 50oC 55oC 60oC 0 2-3-4-5 2-3-4-5 2-3-4-5 2-3-4-5 10‘ 3-4-5 2-3-4 1-2-3 -1-2-3 20‘ 3-4-5 2-3-4 0-1-2 0-1-2 30‘ 3-4-5 2-3-4 0-1-2 0-1-2 40‘ 3-4-5 1-2-3 0-1-2 0-1-2 60‘ 3-4-5 0-1-2 0-1-2 0-1-2 •Ředění •Hodnocení: inaktivační přímka, výpočet ki • 2,3 P0 •Ki = . log • t Pt •P0= pfu/ml v čase t=0 •Pt=pfu/ml v čase t •Indukce lyze buněk UV-zářením •Lyzogenní kmen S. aureus •S26 = NCTC 8511 (53+) •O/N@37oC •6 ml 12878 •100 ml MPB • •4h@37oC •O2 - centrifugace 10.000 ot - 10 min. •sterilně - resuspedovat v 10 ml fosf.pufru - slít dohromady (homogenizace) - po 10 ml na sterilní petriho misky - ozařování UV – 30W, 60 cm -30, 45, 60, 90, 120 sec. 12878 •O2 •10 ml ozářených buněk • 5 ml konc. yeast extrakt • 5 ml konc. bujonu •35 ml fyziol. roztoku •cca 2h@37oC •ve tmě!!! (alobal) - titrace na indikátorovém kmeni • (metoda dvojvrstevného agaru) • NCTC8511 (53-) ředění 10-3 – 10-8 • po dvou miskách •Závěr: tabulka a graf vlivu doby ozáření •Na počet uvolněných fágových částic • 70737D726F7C-6B5B5A5A5A5A5A5A5C625D6C-promyvacka-drechsler-1000ml-2450-kompletni •kultivace 24 h při +37oC •3 ml •200 ml tryptonový bujon kultivace 4 h při 37oC •O2 • • 70737D726F7C-6B5B5A5A5A5A5A5A5C625D6C-promyvacka-drechsler-1000ml-2450-kompletni •kultivace cca 2h při +37oC ve tmě !!!! (alobal) •O2 • •Růstová křivka fága SA 812 •Staphylococcus aureus SA 812 • O/N@37oC •3 ml • 200 ml •tryptonový • bujón •4h, +37oC • • •A260 cca 78% 640px-Erlenmeyer_flask_hg •0,3 ml •30 ml •tryptonový •bujón • ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI • • • • • • 640px-Erlenmeyer_flask_hg •18 ml •+ 2 ml CaCl2 (0,22%) • 5 min. @30oC •Ředění k určení cfu •Fág 812 • pfu 108/ml ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI •0,5ml 640px-Erlenmeyer_flask_hg • ředění k •určení pfu •Čas 0 • 20 • 40 • 60 • 80 • 100 • 120 ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Metoda dvojvrstevného agaru 640px-Erlenmeyer_flask_hg •Staphylococcus aureus SA 812 • O/N@37oC 20 ml •+ 2 ml •CaCl2 •(0,22%) •15ml 640px-Erlenmeyer_flask_hg •150ml • 0,7% • TA •@45oC • • 2% MPA •24h@30oC • 1. •0,1ml •2. 2,5 ml •Závěr: růstová křivka, BS, IR •O2 ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI ANd9GcTzP4ZAwO6lKUTuYEGkZhV2mj2NhTq_tQHUwikzDmhKuOaHnRSVDhNXtVI • • • • • • •2% MPA •24h@30oC •dvojvrstevný • agar •indikátorová • kutura •měkký • agar • bujón s •kulturou •bujón s •kulturou •a fágem 70737D726F7C-6B5B5A5A5A5A5A5A5C625D6C-promyvacka-drechsler-1000ml-2450-kompletni • • • • •3 ml •O2 •kultivace 24 h při 37oC • •(temperace 5 min při 30oC) • •24 h, +30oC • •45oC • •24h, 30oC • • •Staphylococcus aureus SA 812 24 h 37oC C:\Users\Uživatel\Desktop\NEMEC\Disk C\Dokumenty\Skripta fyziol\Podklady\CvFyz 2.jpg • •Příprava hrubého enzymového preparátu (acetonového prášku) • •kultivace 24 h při +30oC • • •kultivace 24 h při +30oC • •nechat sedimentovat C:\Users\Uživatel\Desktop\NEMEC\Disk C\Dokumenty\Skripta fyziol\Podklady\CvFyz 3.jpg •mg/ml • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •Stanovení fosfatázové aktivity nativních buněk a HEP •; PNPP.png •Fosfatázy •Patří do skupiny hydroláz. Štěpí fosfolipidy, fosfoproteiny, glycerofosfáty a další sloučeniny kyseliny fosforečné •Podle vztahu k substrátu • specifické k jednomu substrátu (fosfomonoesterázy, fosfodiesterázy, pyrofosfatázy, amidázy • specifické pro více substrátů (adenozintrifosfáty, fytázy, polyfosfatázy, hexodifosfatázy,metadifosfatázy • alkalické – optimální pH 7 – 8 • kyselé – optimální pH 3,4 – 4,2 •Podle vazby v buňce – volné, vázané, slabě vázané •Kvantitativní stanovení – množství uvolněné látky z chromogenního substrátu. •Substráty - p-nitrofenylfosfát, fenolftaleindifosfát •V případě p-nitrofenylfosfátu- množství uvolněného p-nitrofenolu C:\Users\Uživatel\Desktop\NEMEC\Disk C\Dokumenty\Skripta fyziol\Podklady\CvFyz 4.jpg • •oC • • •t (min) • • •Vliv tepla na fosfatázovou aktivitu hrubého enzymového preparátu • C:\Users\Uživatel\Desktop\NEMEC\Disk C\Dokumenty\Skripta fyziol\Podklady\CvFyz 5.jpg • • Stanovit bílkoviny C:\Users\Uživatel\Desktop\NEMEC\Disk C\Dokumenty\Skripta fyziol\Podklady\CvFyz 1.jpg