Úloha: Izolace spontánních mutant rezistentních ke streptomycinu metodou gradientních ploten Teorie a zahájení pokusu: Molekulární podstata spontánních a indukovaných mutací je stejná. Liší se však ve frekvenci. Frekvence spontánních mutací je podstatně nižší. Tím se také liší od fenotypové modifikace, nebot' ta proběhne prakticky současně ve všech buňkách. Spontánní mutace - rezistence k antibiotikům probíhají dvěma způsoby. Bud' se rezistence k antibiotikům vytvářejí postupně v několika stupních (např. u penicilinu) nebo hned v prvním stupni získáme mutanty rezistentní k různým koncentracím antibiotika. Takto se vytváří rezistence k tetracyklinu. Upozornění: očkování provádět ve sterilním prostředí flow-boxu; použitý materiál pečlivě roztřídit a odnést do umývárny. Objekt: Kmeny Staphylococcus aureus citlivé ke streptomycinu: kmeny S. aureus dle výběru, každá skupina má svůj kmen. Postup: První den. 1. Z 18 hod. kultury vyrostlé na MPA agaru, odebrat 5 kliček a resuspendovat ve 3 ml MPB. Je nutno vyjít z husté bakteriální suspenze (cca 109 buněk/ml), protože frekvence strR mutantů je velmi nízká. 2. Z takto připravené husté kultury provést rozsev ze zředění 10-6 , 10-7 , 10-8 vždy na 3 plotny, pro stanovení celkového počtu buněk v cm3 (tj. titr buněk). Kultivace při 37 °C/20 hod. 3. Připravit gradientní plotny se streptomycinem o výsledných koncentracích: 10, 50, 100 a 500 µg/ml. Pro přípravu zásobního roztoku rozpustit 0,3 g krystalického streptomycinu ve 3 ml sterilní destilované vody (přidávat do roztavené MPA půdy o teplotě max 55 o C). 4. Provést rozsevy po 0,1 ml na gradientní plotny (vždy 2 plotny od příslušné koncentrace, viz obr. 1) a pečlivě rozetřít hokejkou po celé ploše. 5. Naočkované plotny inkubovat dnem vzhůru při 37 o C /24 hod Obr. 1 U kmenů bakterií vybraných do pokusu je třeba provést test citlivosti k antibiotiku. Z připravené suspenze kmene odebrat 0,1 ml a vyočkovat přes 0,7% soft MPA (45 °C) na plotnu s 1,5% MPA. Po utuhnutí vykápnout antibiotikum (10, 50, 100 a 500 µg/ml) na povrch agarové plotny, a po vsáknutí kultivovat při 37 °C/20 hod. Druhý den. Stanovit titr buněk ve výchozí suspenzi Vyhodnotit test citlivosti kmene k antibiotiku Rozhodnout o dalším pokračování pokusu dle nárůstu „mutant“. Jednotlivé kolonie za linií kompaktního nárůstu představují domnělé mutanty (viz obr. 1). Dle nárůstu je třeba rozhodnout, zda je nutno prodloužit kultivaci o další den. Pokračování pokusu se bude rozhodovat dle nárůstu mutant. Ukončení pokusu. Z výsledků stanovit koncentraci, ke které je kmen rezistentní a určit frekvenci mutací k jednotlivým koncentracím streptomycinu. Výpočet mutačního indexu (frekvence) mutant: F = titr mutant : titr buněk Vypracovat protokol: protokol obsahuje fotografickou dokumentaci výsledků pokusu Materiál na 1 skupinu. Na inokulum dvou kmenů 2 misky s 2% MPA – očkuje se křížovým roztěrem den před zahájením pokusu Kmeny: dle výběru vyučujícím 3 dny před pokusem vyset ze zmražených konzerv na Petri misky a ověřit schopnosti růstu. MPB: na ředění: 20 ml MPB Na proužkování: 20 ml MPB Na suspenzi mutant: 3 ml MPB MPA: Na titr buněk SAU: 300 ml MPA MPA na gradientní plotny: 160 ml na podkladovou vrstvu 4 × 50 ml MPA (zvlášt v Erlenkách) na 4 různé koncentrace streptomycinu Navážka STRE 0,3 g antibiotika. Rozpouští se až těsně před použitím ve ve 3 ml sterilní destil. vodě a uchovává se v temnu a chladu. Na test citlivosti ke STRE 2 Petri misky s 2% MPA. Je nutné mít sterilní hokejky a 25 ml pipety s upravenou špičkou