§ METODY FAGOCYTÓZY - vyšetření zahrnuje: À krevní diferenciál - % zastoupení LEU Á izolace LEU Â stanovení funkce LEU 4 skupiny testů na fagocytózu: test na schopnost fagocytů odpovídat na chemotaktické stimuly /CHTS/ testy na sílu ADHEZE a INGESCE testy na mikrobicidní aktivitu LEU testy na metabolickou aktivitu LEU test na schopnost fagocytů odpovídat na chemotaktické stimuly /CHTS/ ·test migrace pod agarózou - postup: nalití agaru na misku a vyřezání otvorů · plnění otvorů látkami • kultivace, usmrcení BB, barvení • odstranění agaru, mikroskopování • •princip •CHEMOTAKTICKÝ STIMUL •* vnitřní – produkty vlastních BB – komplement, imunokomplex, IL, prostaglandiny •* vnější – produkty ze stěn mikrobů – lipopolysacharid, GLP, manan • •CHEMOTAKTICKÝ INDEX : •aktivní pohyb •difuze •CHI = A/B >1 • CHTS •CHTS •LEU •Fyziol. roztok testy na sílu ADHEZE a INGESCE •A)test s metakrylátovými částicemi •LEU (popř. krev) + � MSHP /inertní metakrylátové částice/ • • •na • testadaing •na povrchové receptory fagocytu se naváží MSHP •necháme kultivovat, barvíme -počítá se: fagocytární index (FI) a procenta fagocytózy (%F) •FI = počet fagocytovaných částic na povrchu, uvnitř/ lomeno počtem fagocytujících BB • %F = počet fagocytujících BB / celkový počet BB x 100 B) test s kadmium-albuminovými částicemi -počítá se: fagocytární index (FI) a procenta fagocytózy (%F) •FI = počet fagocytovaných částic na povrchu, uvnitř/ lomeno počtem fagocytujících BB • %F = počet fagocytujících BB / celkový počet BB x 100 •Testy na mikrobicidní aktivitu LEU • · test na počet přeživších bakterií •kultivace • BAKTERIE ubytekbakterii • • • • -hodnocení: •* bakterie se vysejí na plotny •* spektrofotometricky, úbytek zákalu •· KANDIDATIVNÍ test – test na počet přeživších kvasinek •LEU+Candida •úbytek kvasinek, Trypanová modř - mn. přeživších buněk •mikroskop Testy na metabolickou aktivitu LEU, NBT test •hodnocení: - pod vlivem CHTS při kultivaci dojde k fagocytóze, jejíž součástí je oxidativní vzplanutí -Redukce vlivem oxidačních pochodů v buňce. NBT nitroblue tetrazolium chlorid bezbarvý se změní na modrý formazán – stanovení SPEKTROFOTOMETREM -Touto metodou se prokazuje hlavně schopnost fagocytů tvořit kyslíkové radikály aktivací NADPH oxidázy •redukce •CHEMILUMINISCENČNÍ test •pro kvantitativní hodnocení oxidativního vzplanutí •Vznikají elektronově excitované stavy, které emitují fotony. Emitované fotony zachycovány tzv. luminoforem (luminol, izoluminol nebo lucigenin), spontánní a aktivovaná CL (pomocí zymozanu), luminometr • NADPH • oxidáza • •O2 + el O2- . radikál, anion • • •Dalšími reakcemi vznik kyslíkových radikálů •luminometr •plus luminol Metody fagocytózy •VYUŽITÍ v praxi : •zjištění : * nedostatečnosti či poruch jednotlivých fází fagocytózy •* aktivity fagocytů u pacientů s opakovanými infekcemi, opakovanou léčbou antibiotiky, nádorovým onemocněním, artritidou či revmatoidními onemocněními, při zátěžových situacích •