Koncepce předmětu spec. imunolog. metody Bi 9250C, zimní semestr 2016 Časový rozpis blokového cvičení z předmětu Speciální cvičení z imunologie 16 studentů, 2h/2kredity Pomůcky s sebou: Přezůvky a plášť, protokoly, svačina, kdo má malý foťák V praktickém cvičení se budeme zabývat testy sledujícími aktivitu IS a) bezobratlých b) obratlovců Metody: Odběr a zpracování krve (krevní diferenciál), hemolymfy; Imunodifúze – Manciniová, Ouchterlony modifikace; ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. (Borrelia afzelii, garinii, sensu stricto); Test aktivity lymfocytů; rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti Ag nebo Ab; Test ALT - podle času (stanovení aktivity jaterního enzymu), Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu); Test aktivity fagocytózy pomocí fagocytovaných částic u hemocytů hmyzu; Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka – nepřímá hemaglutinace (HIT). Termín: Po.-čt. 23.1 – 26.1. a od 30.1. – 2.2. od 8.30hod Po 8:30 Instruktáž: ke cvičení toho dne 1. ALT, 2. krevní roztěr, barvení a příprava séra 3. příprava destiček na ELISA, imunochromatograf. test HIV-v případě času, ruleta na další testy. postupný odběr krve z prstu, ELISA - Et OH, promývání destiček, zjišťování konc. antigenu, ředění Ag, kalibrační křivka a napipetování na destičku; v mezičase barvení roztěrů a krevní diferenciál; ruleta na imunochromatický test, zpracování krve na sérum Pomůcky: ELISA: připravené A volné destičky, Ag už sonifikovaný, albumin, činidla na kalibraci, vazebný rozt ok, lednička, et-OH Předání pokynů a protokolů na imunochromatografický test- ruleta ALT: sérum, ELISA reader s filtrem 340 nm, epiny, destičku Odběr krve: rukavice, ependorfky, stojánek, skla na roztěr, desinfekce, jehly, souprava na barvení- Leukodif Pipety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, papírky na ruletu út 8:30 Instruktáž: 1. imunochromatografické testy 2. imunodifuze, 3. odběr hemolymfy z larev Zavíječe vosk ového, kultivace se škrobovými částicemi a sledování fagocytárních schopností hemolymfy, barvení sk el a prohlížení pod mikrokopem, promytí destiček na ELISA ELISA-pokračování: odstranění Ag a promytí, napipetování vazebného roztoku s kaseinem, inkubace s k aseinem, promytí destiček; v mezičase imunochromatografické testy, mezitím imunodifúze; odběr hemolymfy z larev Zavíječe voskového, kultivace se škrobovými částicemi a sledování fagocytár ních schopností hemolymfy, barvení roztěrů a pozorování pod mikroskopem hemocytů, počítání FI a % F , krevní diferenciál – dokončení Imunodifúze: pipety, skla na imunodifúzi, vlhké komůrky, nůžky Pomůcky: ELISA: blokovací-vazebný roztok s kaseinem, promývací roztok, promývačka Fagocytóza: Leukodif, roztok škrobových zrn, larvy, sklíčka na roztěry, termostat, malé epiny, pinzety, nůžky, stříkačky a jehly Pipety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, teplotní lázeň, malý termostat st 8:30 Instruktáž: 1. Test aktivity lymfocytů. 2. Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka, v mezičase počítání krevní diferenciál Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu), barvení buněk - dokončení Test aktivity fagocytózy pomocí škrobových zrn u fagocytů hmyzu, barvení buněk - počítání dokončení , Pomůcky: Komerční séra (EXBIO Olomouc) anti-A (IgM) monoklonální1, anti-B (IgM) monoklonální, lektin anti-H monoklonální; náplav diagnostických erytrocytů A,B,O; destičky s otvory, fyziologický roztok 0,85% (0,15 mmol/l) NaCl, vodní lázeň na 100 C°, vortex, stojánky na zkumavky, štítky, fixy. čt 8:30 Instruktáž: 1. samotná ELISA ředění sér, rozložení vzorků na destičku, příprava zředěných sér: inkubace destičky se séry (naředit konjugát), promytí destičky, nanesení konjugátu, inkubace s konjugátem (nachystat substrátový roztok s OPD), promytí a nanesení substr. roztoku, inkubace se substrátem, zastavení reakce pomocí H[2]SO[4], měření na ELISA-readeru, v mezičase: krevní diferenciál, FI, % fagocytózy. Pomůcky: ELISA: blokovací roztok, promývací roztok, promývačka, konjugát, substrátový roztok, substrát, H[2]SO[4], ELISA-reader na 492 nm Pipety, špičky, stojánky, ependorfky Přehled metodik: Odběr a zpracování krve, příprava séra, stanovení krevního diferenciálu Imunodifúze – metoda Manciniová, Ouchterlony ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. Test aktivity lymfocytů, ATP test Test aktivity jaterních buněk, ALT test Rychlý kvalitativní test pro stanovení přítomnosti HIV viru Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti hemoglobinu ve stolici - individuální stanovení Rychlý test ze slin pro odhad hladiny alkoholu v krvi Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti H. pylori ve stolici Rychlý test pro stanovení Streptococcus A (pyogenes) ve stěru hrdla Rychlý test pro stanovení Streptococcus pneumoniae v moči Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu), barvení buněk Test aktivity fagocytózy pomocí škrobových zrn u fagocytů hmyzu, barvení buněk Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka (HIT)