Stanovení ALT (Alaninaminotransferáza) v séru člověka Teorie: Aminotransferázy jsou enzymy usnadňující přeměnu jedné aminokyseliny v jinou. Tím pomáhají udržovat vyvážený přísun aminokyselinových jednotek potřebných pro syntézu bílkovin. Zvýšená aktivita alaninaminotransferázy je významným indikátorem aktivity jater, srdce a kosterního svalstva. V praxi jsou transaminázy látky tělu vlastní, které se obvykle nacházejí v buňkách. ALT transamináza je obsažena převážně v buňkách jater, srdce, kosterních svalů, ledvin, mozku a v červených krvinkách Po jejich rozpadu přecházejí do krevního séra. Zvýšená hodnota ALT znamená tedy zvýšený rozpad buněk v těchto oblastech. Norma: 0,06 – 0,14 ukat/l Hraniční hodnota: 0,42 ukat/l Úkol: Stanovit ALT v séru člověka Pomůcky: stojánek na eppenndorfky nastavitelné pipety termolázeň na 37^oC ELISA-reader s filtrem o vlnové délce 340 nm Princip metody: alaninaminotransferáza (L-alanin: 2-oxoglutarátaminotransferasa E.C.2.6.1.2) katalyzuje reakci mezi L-alaninem a 2-oxoglutarátem, které převádí na L-glutamát a pyrohroznan, Stanovení je založeno na měření absorbance hydrazonů kysein 2-oxoglutarové a pyrohroznové v alkalickém prostředí. Hydrazon kyseliny pyrohroznové má vyšší absorbanci. L-alanin + oxoglutarát ® pyruvát + L-glutamát Pyruvát + NADH + H^+ ® laktát + NAD^+ Katalytická koncentrace ALT je úměrná poklesu absorbance při 340 nm. Činidla R1. Pufr: Tris pufr pH=7,5, L-alanin, LD LD ³ 2,5 mkat NADH ³ 21,6 mmol/lahvičku R2. Startér NADH, 2-oxoglutarát 180 mmol/l Azid sodný 0,1 % Aktivátor Pyridoxal-5-fosfát 6 mmol/tabletu Kalibrace BIO-LA-TEST LYONORM KALIBRÁTOR, kat. č. 10003200 (1,36 mkat/l), 3204,3206 Příprava pracovního roztoku 25% hmotnosti obsahu lahvičkys činidlem 1 se rozpustí v 25ml roztoku činidla 3. Po rozpuštění se přidá půl tablety činidla 4. Postup analýzy Vzorky: nehemolytické sérum, heparinizovaná nebo EDTA plazma Vlnová délka: 340 nm ELISA destička Teplota: 37 °C pracovní roztok 100 ml sérum 10 ml Promíchá se a inkubuje 10 minuty při 37 °C Přidá se činidlo 2 v mnžství 10µl Promíchá se, inkubuje se 2 a minuty při 37 °C měří se absorbance v 1 minutových intervalech nejméně po dobu 3 minut. Vypočte se průměrná průměrná změna absorbance za 1 min (A). A= průměr (A1+A2+A3)