C5720 Biochemie
12-Enzymová kinetika
11/5/2013
1
Petr Zbořil

Obsah
•Rychlost a aktivita
•Kinetika
•Organizace a regulace
•Praktické aspekty
11/5/2013
Petr Zbořil
2

Vyjadřování katalytické účinnosti enzymů
•Vyjádření množství (koncentrace) enzymů
ojak čistých tak v komplexní proteinové směsi
ohmotností, látkovým a katalytickým množstvím (koncentrací)
oúčinnost enzymu - aktivity - odvozena od rychlosti enzymové reakce – jako množství přeměněného
substrátu či vzniklého produktu za časovou jednotku. Tato rychlost (dc/dt) se stanovuje vhodnými
metodami, s výhodou fotometricky.
•Jednotky aktivity
oSmluvní jednotky – např. u amylasy - množství enzymu, které rozštěpilo za 30 min při 40 oC dané
množství škrobu aby ten nedával reakci s jodem
oIU - mezinárodní jednotky 1961 – množství enzymu, jež přeměnní 1 µmol substrátu za 1 minutu za
standardních podmínek (pH, T, přebytek substrátu, přítomnost aktivátorů)
oKatal (podle soustavy SI) 1971 - množství enzymu, jež přemění 1 mol substrátu za 1 sekundu za
standardních podmínek (pH, T, přebytek substrátu, přítomnost aktivátorů)
•Specifická aktivita
oaktivita vztažená na celkové množství (koncentraci) vztažného parametru( bílkoviny) – katal/g
•Číslo přeměny
olátkové množství substrátu (mol) přeměněné molem enzymu za časovou jednotku (s) – k [s-1]
•
11/5/2013
Petr Zbořil
3

Rychlost reakce
•
•Určující charakteristika
odc/dt, z toho pak aktivita
•Metody stanovení
oStanovení [P] nebo [S] – pak –dc/dt
oVýhodnější [P], ale záleží na možnostech metody
oSpektrální – absorpční, fluoresceční aj., chemické, elektrochemické (amperometrie), enzymové
(spřažené reakce)
•Vliv prostředí
oOptimalizace podmínek – aktivita
•
•
11/5/2013
Footer Text
4

Rychlost reakce
•
•Pokles dc/dt
•dc/dt pro t = 0
•Rovnováha – lim.
•různé vlivy
•přiblížení K
•inaktivace
•
11/5/2013
Footer Text
5
22.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Vliv prostředí na rychlost enzymové reakce
•Optimální podmínky
oIn vivo – fysiologické prostředí
oIn vitro – napodobení – snaha
•I – obvykle odpovídá 0,9% NaCl, výjimky, extrémy
•pH – obvykle neutrální, výjimky, extrémy
•T – teplokrevní x studenokrevní, mikroorganizmy aj.
oDenaturace x syntéza in vivo
oKonvenční hodnoty in vitro – 30oC
otermofilové
•Další – regulátory
•
11/5/2013
Petr Zbořil
6

Vliv pH
11/5/2013
Petr Zbořil
7
Aktivita x rychlost, Gaussovská závislost

Vliv teploty
11/5/2013
Petr Zbořil
8
„Optimum“ – závisí na dalších podmínkách, doba měření aj.
k=Ze^{\frac{-E^a}{RT}}
Arrheniovo x běžné
vynesení – v = f(T)

Linearita
11/5/2013
Petr Zbořil
9
Oblast kde lze měřit
v0 pro t = 0!

Kinetika enzymové reakce
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•Časový průběh enzymové reakce – prestacionární a stacionární stav
•
11/5/2013
Petr Zbořil
10
24.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Stacionární kinetika
•
•              k1                    k3
•E + S     ↔     ES     ↔     E + P v1 = k1.[E].[S] v2 = k2.[ES]
•              k2               k4   v3 = k3.[ES] v4 = k4.[E].[P] (= 0)
•
•Za stacionárních podmínek v1 + v4 = v2 + v3
•
• k1.[E].[S] + 0 = k2.[ES] + k3.[ES] = (k2 + k3).[ES]
•
• [E].[S] / [ES] = (k2 + k3) / k1 = Km, pro k2 ›› k3  Km = Ks
•
• v0 = k . [ES] Vlim = k. [E]t = k.([E] + [ES])
•
•                     Vlim . [S]
• v0 =    -------------
•                      KM + [S]
•
11/5/2013
Petr Zbořil
11

v0 = f([S])
• Vlim . [S]
•v0 =     ----------------
• Km+ [S]
•
•Rovnice
•Michaelise-Mentenové
•- hyperbolický průběh
•
•Speciální případy
o[S] ◄ Km
o[S] ► Km
o[S] =  Km   v0 = Vlim / 2
o
11/5/2013
Petr Zbořil
12
21.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Stanovení kinetických parametrů
•Rektifikace vztahu
oRůzné úpravy – vynesení (Hanes, Hofstee aj.)
oVynesení dle Lineweavera a Burka
o1/v0 = f(1/[S])
•Rovnice přímky y = ax + b
•
•
11/5/2013
Petr Zbořil
13

Stanovení kinetických parametrů
•
•
•       y       =                a .  x   +   b
•
•
11/5/2013
Petr Zbořil
14

Stanovení kinetických parametrů
11/5/2013
Petr Zbořil
15
81.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Význam nalezených konstant
•
•Km je mírou afinity substrátu k enzymu
oformálně disociační konstantou komplexu [ES]
oNení závislá na katalytickém množství (aktivitě enzymu) v pokusu, pokud pracujeme v oblasti
lineární závislosti v na [E] – viz výše.
oLze ji tabelovat a užít jako srovnávací parametr
oMění se s externími parametry
•Liší se pro různé substráty téhož enzymu
oAlternativní
oKosubstráty – NAD apod. (LDH)
oVztah k metabolickým hotovostem – „pool“
11/5/2013
Petr Zbořil
16

Význam nalezených konstant
•
•Vlim je ukazatelem aktivity enzymu
oZávisí na katalytickém množství enzymu v experimentu, není konstantou obecnějšího rázu, lze
nahradit v0 při nadbytku S
oDá se užít k vyjádření katalytické účinnosti a čistoty enzymu. V těchto případech se vypočítá tzv.
specifická aktivita jako poměr Vlim a množství enzymu (typicky v mg bílkoviny neznáme-li jeho
Mr nebo pracujeme se směsí – homogenát, krevní sérum apod.)
oZnáme-li látkové množství enzymu, pak specifickou aktivitu vztaženou na látkové množství enzymu
nazýváme číslem přeměny (TN):
•
• Vlim / [E] [mol.s-1/mol] = TN [s-1] = kcat
•
11/5/2013
Petr Zbořil
17

Význam nalezených konstant
11/5/2013
Petr Zbořil
18
26.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Význam nalezených konstant
•Čísla přeměny
•
•
11/5/2013
Footer Text
19
27.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Význam nalezených konstant
•Konstanta specificity
opoměr kcat (vyšší – účinnější katalýza) a Km (nižší – větší afinita enzymu k substrátu)
ospolehlivější ukazatel substrátové specificity – preference substrátů
omodelově estery, specificita k aromatickým acylům
11/5/2013
Petr Zbořil
20
28.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Regulační aspekty
•
•Vliv [S] na rychlost
oMichaelisovská
okinetika
•Alosterické enzymy
oOligomerní
oKooperativita
oEfektivní regulace
oNeřídí se
oMichaelisovskou
okinetikou
•
•
11/5/2013
Footer Text
21
36.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Modulace rychlosti enzymové reakce
•Metabolický význam – in situ
oRegulace metabolismu
•Studium metabolismu – in vitro
oObjasnění mechanizmu působení enzymů
oSoučást regulací jako celku
•Způsoby – účinek metabolitů, modifikace apoenzymu
oModulátory, efektory
oPositivní – aktivátory
oNegativní - inhibitory
•
•
•
11/5/2013
Petr Zbořil
22

Inhibice enzymové aktivity
•
•Typy inhibitorů
•Ireversibilní
oVážou se pevně a nevratně
oLze reaktivovat chemickou reakcí
o
•Reversibilní
ointeragují s enzymem vratně
odají se odstranit např. dialýzou, gelovou chromatografií
oKompetitivní
oNekompetitivní
oAkompetitivní
o
11/5/2013
Footer Text
23

Ireverzibilní inhibice
•Modifikační činidla
•Studium aktivního
•centra
•
•
•
•
•
•
•Organofosfáty
11/5/2013
Footer Text
24
43.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Ireverzibilní inhibice
•SH-inhibitory
•
•
•
•
•
•
•
•Alkylační činidla, rtuťnaté sloučeniny (PCMB)
11/5/2013
Footer Text
25
44.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Reverzibilní inhibice
•Kompetitivní
oInhibitor se váže do aktivního místa
oStrukturní podobnost se substrátem
oSoutěžení inhibitoru se substrátem
•Nekompetitivní
oInhibitor se váže jinak
oSubstrát neovlivní vazbu inhibitoru
•Akompetitivní
oInhibitor se váže na komplex ES
•Alosterická
oVazba na jinou podjednotku
•
•
•
11/5/2013
Footer Text
26
37.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Kompetitivní inhibice
•Inhibice SDH malonátem
oJantaran (sukcinát) je substrátem enzymu sukcinátdehydrogenasy (vzniká fumarát)
oMalonát je kompetitivním inhibitorem SDH (nelze ho dehydrogenovat)
oStrukturní podobnost, někdy bývá méně názorná (el. hustoty)
oUrčení typu inhibice kineticky
•
11/5/2013
Footer Text
27

Kompetitivní inhibice
•Inhibice DHF reduktázy
oAntimetabolit, cytostatikum
oSyntéza tyminu aj. – BcII
oDalší analoga
11/5/2013
Footer Text
28
38.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Kompetitivní inhibice
•Kompetitivní inhibitor
oreaguje s volným enzymem
oa soutěží se substrátem
ovazné místo v aktivním centru.
oMůže se navázat pouze
ona volný enzym
oV reakční směsi se pak
ovyskytuje mimo E, S a ES
oještě EI (komplex enzym-inhibitor),
okterý se tvoří vratně mezi
ovolným enzymem a inhibitorem
11/5/2013
Footer Text
29
41.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Kompetitivní inhibice
•Kinetická analýza
•
•   Oproti neinhibované reakci zahrnuje
•
• Ki = [E] . [I] / [EI] a pak  [E]t = [E] + [EI] + [ES]
•   dále
• v = Vlim . [S] / [Km (1+ [I]/ Ki) + [S]], kde Km (1+ [I]/ Ki) = Kapp
•   a po rektifikaci
• 1/v = 1/ Vlim + Kapp/ Vlim . 1/[S]
•
•Výraz Kapp nazýváme zdánlivou Michaelisovou konstantou
• je vyšší než skutečná přímo úměrně [I] a nepřímo Ki
• vliv kompetice
•Vlim se nemění
•
•
•
•
11/5/2013
Footer Text
30

Kompetitivní inhibice
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•Grafické vyjádření této závislosti vidíme na vynesení dle Lineweavera a Burka
•
11/5/2013
Footer Text
31
82.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Nekompetitivní inhibice
•Inhibitor není podobný substrátu
-váže se jak na volný E
•tak komplex ES
-Vytváří komplex EI
-[EI] nezávisí na [S],
•ale pouze [I]
•  Et + I = EI
•
•
11/5/2013
Footer Text
32
42.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Nekompetitivní inhibice
•Zavedením do základní rovnice Michaelise a Mentenové pak dostáváme
•
•   v = (Vlim . [S]) / (Km + [S]).(1+ [I]/Ki)
•a po rektifikaci
• 1/v = (1/ Vlim + Km/Vlim . 1/[S]) . (1+ [I]/Ki)
•
•Km se nemění
• Vlim se snižuje úměrně poměru [I]/Ki
•
11/5/2013
Footer Text
33

Nekompetitivní inhibice
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•Grafická analýza dle Lineweavera a Burka
11/5/2013
Footer Text
34
83.jpg 00035B30 Hard Drive B78AEAA7:

Isoenzymy
•
•Stejná aktivita
oLiší se apoenzym
oPodjednotkové složení
oKinetické odlišnosti
•Význam
oPříklad LDH
o
11/5/2013
Footer Text
35

Isoenzymy
•Orgánová specificita
o
11/5/2013
Footer Text
36

Zymogeny - proenzymy
•Neaktivní formy
•Posttranslační modifikace
•Význam – proteázy
•
11/5/2013
Footer Text
37

Organizace enzymů
•
•Efektivita reakcí
oKatabolické – jednodušší
oAnabolické – význam organizovanosti
•Typy
oenzymy volně rozpuštěné (cytoplasma – glykolýza)
omultienzymové komplexy (zvl. pro anabolické pochody – syntéza MK, ale i katabolické pochody –
využití energie)
omembránově vázané enzymy (organizovanost, vektoriální průběh reakcí – využití energie – oxidační a
fotosyntetická fosforylace)
•
11/5/2013
Footer Text
38

Praktické využití enzymů
•Průmyslové využití
oPrací prostředky
oKrmivářství
oPotravinářství
oFarmacie
•Lékařství
oDiagnostika
•Analyt, nástroj
oTerapie
•Substituční, podpůrná, speciální
•Bioanalytická chemie
oStanovení substrátů
oStanovení inhibitorů
•Enzymová katalýza v organické chemii
oStereoselektivita, kombinace metod
•
11/5/2013
Footer Text
39