Martin Olbert Ústav Biochemie (A5) Vedúci: prof. RNDr. Igor Kučera, DrSc. Konzultant: Mgr. Vojtěch Sedláček, Ph.D. *- G- baktérie * *- aeróbne aj anaeróbne podmienky * *- rozmanité substráty: methanol, vodík, síra... * *- denitrifikačné vlastnosti * *- hypergravitácia - * zdroj: http://genome.jgi.doe.gov/parde/ Paracoccus denitrificans je pôdna G- baktéria, ktorá je schopná života za anaeróbnych aj aeróbnych podmienok, tým pádom používa rôzne substráty. Za anaeróbnych podmienok sa prejavujú jej denitrifikačné vlastnosti. Zaujímavosťou je, že sú odolné voči silnej gravitácii. *- anaeróbne podmienky (bez O2 za prít. NO) * *- redukcia z dusičnanov na dusík: *NO3- → NO2 - → NO → N2O → N2 * *- 4 reduktázy potrebné k reakcii * *- využitie v biotech., odstraňovanie NO2 - z pitnej vody * V anaeróbnych podmienkach sa prejavuje ich schopnosť spracovávať dusičnany na čistý dusík a uvoľňovať ho tak do atsmoféry. Deje sa tak v štyroch krokoch a sú tu potrebné enzýmy (reduktázy). Využitie je pomerne širospektrálne všade tam, kde je potrebné sa zbavovať dusíka, napríklad pri odstraňovaní NO[2 ]z pitnej vody. -ROS - -FerB – cytoplazmatický flavoproteín - -FnrP transk. faktor rozložený ROS - -N2O reduktáza (prerušená denitrifikácia) * * na baktérie takisto pôsobí oxidačný stres, reaktívne formy kyslíka (ROS). Jedným z obranných mechanizmov je tvorba FerB flavoproteínu, ktorý napomáha v likvidovaní ROS. Avšak pri veľmi vysokej koncentrácii ROS dochádza k rozkladu FnrP v strede molekuly a obranná funkcia bunky je narušená. Dochádza aj k zastaveniu denitrifikácie. *- prestáva využívanie síry bunkou * -aktivácia génov pre *monooxygenázy - -vstupujú do boja proti *oxidačnému stresu * * * zdroj: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874391915002201 Vplyvom ROS bunka prestáva využívať síru ako substrát a dochádza k aktivácii génov pre monooxigenázy, ktoré sa takisto zapájajú do boja proti ROS. Na obrázku je znázornené, ako sú usporiadané jednotlivé génové skupiny pre expresiu monooxigenáz. * - expresia génov pre tvorbu monooxygenáz * * - exprimovanie 4 génov: 4106/5007/5013/5125 * * - zistenie štruktúry, popis vlastností Hlavným cieľom práce je exprimovanie 4 génov a získanie proteínov (monooxygenáz) v natívnej forme. Následne bude potrebné zistiť presnú štruktúru, popísať vlastnosti a overiť, akým spôsobom sa presne zapájajú do obranného mechanizmu baktérie. *- izolácia cDNA P. Denitrificans * *- izolácia génov reštriktázami * -amplifikácia PCR - -vkladanie do vektora pGEM, transformácia do kmeňa E.Coli a kontrola inzercie * * Najskôr bolo potrebné izolovať cDNA z našej baktérie P. denitrificans. Samotné gény sme izolovali špecifickými reštriktázami, ktoré nám vystrihli samotné gény. Následne sme ich amplifikovali pomocou PCR a skúšobne vložili do vektora pGEM, následne transformovali do E. coli a skontrolovali správnosť inzercie. -vloženie do vektora pET21, ligácia - * - vloženiu vektora pET21 s génom do kompetentných E.Coli a kontrola inzercie * * - preklonovanie plasmidu do expresného kmeňa E.Coli BL21 * *-expresia a izolácia proteínov pomocou afinitnej chromatografie * Po kontrole v pGEM vektore sme sme naše gény izolovali a pripravili, a takto pripravené následne ligovali do pET21 vektora. Pripravili sme kompetentné baktérie E. coli a skontrolovali inzerciu. Plasmid sme následne preklonovali do expresného kmeňa E. Coli BL21. Po kultivácii sme kolónie rozsuspendovali a snažili sa izolovať naše cielené proteíny pomocou afinitnej chromatografie. *4106 – pET21 – exprimuje, pokus o purifikáciu *5007 – pET21 – neexprimuje *5013 do pET21 vligovať *5125 do pGEM vligovať K výsledkom sa snažíme postupne dopracovať, zatiaľ sme v stave získať natívny proteín. Hore v prezentácii je uvedené ako postupujeme s jednotlivými génmi.