FAMILIÁRNÍ HYPERCHOLESTEROLEMIE
A FUNKČNÍ ANALÝZA
Jana Pavloušková, 1.11.2016
FAMILIÁRNÍ HYPERCHOLESTEROLEMIE (FH)
 Autosomálně dominantně dědičné onemocnění
 Příčiny:
 Nejčastěji mutace v genu pro LDL-receptor (LDLR)
 Méně často mutace v genu pro jeho ligand – apolipoprotein B 100 (APOB)
 Vzácně i specifický typ mutace v genu pro proprotein konvertázu subtilisin-kexin typu 9 (PCSK9)
http://www.studyblue.com (upraveno)
 V důsledku mutací je v hepatocytech zásadně zpomaleno odstraňování lipoproteinů o nízké
hustotě (LDL) z krve a hladina LDL-cholesterolu se tak velmi výrazně zvyšuje
 Léčba:
 Zdravá výživa a dostatek pohybu (jako u běžně zvýšeného cholesterolu)
 Nutné podávat léky snižující cholesterol (zejména statiny)
 U těžkých případů plazmaferéza (očištění krve od tukových částic)
PROJEVY FH
http://www.studyblue.com (upraveno)
 Velmi vysoká hladina LDL-cholesterolu výrazně urychluje rozvoj aterosklerózy
 Kardiovaskulární onemocnění (především infarkt myokardu) se mohou objevit již ve velmi časném
věku
 Ukládání cholesterolu do podkoží - podkožní boule (xantomy) nebo žlutavé plochy na kůži
(xantelasmata), prstenec kolem rohovky oka
Arq. Bras. Cardiol.,
2000
Issa et al.,Arq. Bras. Cardiol., 2000
www.tribune.cz
VÝSKYT FH
 FH patří mezi relativně častá vrozená onemocnění
 Frekvence výskytu heterozygotní formy FH v evropské i severoamerické populaci donedávna
odhadována na 1:500 (předpoklad v ČR asi 20 000 pacientů s FH)
 Recentní statistiky založené na populačním screeningu v některých evropských zemích ale
ukazují, že skutečná frekvence heterozygotní FH může být až 1:250
 Homozygotní forma FH je vzácnější
 Výskyt odhadován na 1:1 000 000, nedávné studie zaměřené na dánskou populaci však odhadují
prevalenci homozygotní FH na 1:160 000– 300 000
HLADINA CHOLESTEROLU
 Hladina HDL-cholesterolu i triglyceridů bývá většinou fyziologická
 Heterozygotní forma FH:
 Celkový cholesterol nad 8 mmol/l (obvykle kolem 9–12 mmol/l)
 LDL-cholesterol nad 5 mmol/l (obvykle 6–9 mmol/l), může být ale i vyšší
 Homozygotní formy FH:
 Celkový cholesterol nad 12 mmol/l
 LDL-cholesterol nad 10 mmol/l
 Hladiny krevních lipidů mohou mít značnou variabilitu - v závislosti na typu mutace, na životním
stylu či jiných přidružených onemocněních
PROJEKT MEDPED (MAKE EARLY DIAGNOSES TO PREVENT EARLY DEATHS)
 Mezinárodní projekt, úkolem je aktivní vyhledávání pacientů (a jejich příbuzných) se závažnými
formami dyslipidémie (především nemocných s FH)
 Funguje v ČR již od roku 1998
 Síť center
 Zajištění diagnostiky FH podle doporučených postupů včetně molekulárně-biologické diagnostiky,
cílený screening v rodinách, dispenzarizace a evidenci nemocných v celostátní databázi,
komplexní péče včetně farmakoterapie
 V databázi projektu MEDPED v ČR bylo v roce 2015 více než 6300 pacientů s FH
 V počtu diagnostikovaných a léčených pacientů s FH na počet obyvatel je ČR na 3. místě na
světě
MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA
 Analýza ukončena u 3900 probandů
 Mutace v LDLR nalezena u 833 probandů (21,4%)
 Mutace v APOB nalezena u 377 probandů (9,7%)
 Celkem nalezeno 180 unikátních alelických variant genu LDLR
 69,4% substituce
 19,5% malé delece/inzerce
 11,1% rozsáhlé přestavby
 71 alelických variant dosud nebylo popsáno
 Tichý et al., Atherosclerosis 2012
http://www.studyblue.com (upraveno)
APOB100
Ren et al., PNAS, 2010
 2. chromozom
 Gen společný pro ApoB100 i ApoB48 (tkáňově specifický alternativní sestřih)
 Protein: 4563 aminokyselin
 Ligand LDL receptoru
 DNA diagnostika - detekce nejčastější mutace p.Arg3527Gln
 Chromozom 1
 12 exonů
 Protein: 692 aminokyselin
 K fenotypovému projevu FH je nutná gain of function mutace
 Loss of function mutace způsobují opačný fenotyp (hypocholesterolemie)
(Soutar et Naoumova, 2007, upraveno)
PCSK9
LDL RECEPTOR
 19. chromozom, 45kb, 18 exonů
 Gen patří do rozsáhlejší rodiny LDL receptorových genů
 Vznikající prekurzorový protein má délku 860 aminokyselin – obsahuje signální sekvenci
(21 aminokyselin) na N-konci
- odstřižena během přesunu do ER
 Výsledný protein 839 aminokyselin
Herz et al., Nature reviews Neuroscience, 2000
STRUKTURA LDL RECEPTORU
N-koncová doména / ligand-vazebná
 Tvořena sedmi repeaty (~50% sekvenčně identické)
 Každý repeat obsahuje přibližně 40 aminokyselin včetně 6 cysteinových residuí, které formují disulfidické
můstky
 Pro vazbu ApoB jsou stěžejní repeaty 2 – 7, pro vazbu ApoE repeat 5
EGFP doména
 3 repeaty, dva jsou blízce spojeny, poslední je od nich oddělen oblastí bohatou na YWTD (tyrosin, tryptofan,
threonin, kysl. aspartová)
YWTD repeat region
 Zaujímá beta-propeller konformaci
 Tato oblast je zodpovědná za změnu konformace v důsledku změny pH okolí, díky čemuž je uvolněna LDL
částice v endozomu
Doména bohatá na O-vázané oligosacharidy
 Neprojevuje žádnou funkci – experimentálně se neukázala významná ztráta funkce receptoru bez této domény
Cytosolická C-koncová doména
 Obsahuje ~50 aminokyselin
 Zahrnuje sekvenci důležitou pro formaci klatrinových váčků a pro spuštění receptorem zprostředkované
endocytózy po navázání LDL částic
Transmembránová doména
 Složena z 22 (většinou) nepolárních residuí
 Prochází plazmatickou membránou jako alfa-helix
http://www.nature.com/nsmb/journal/v8/n6/images/nsb0601_476_F1.gif
METABOLICKÁ DRÁHA LDL RECEPTORU
1. syntetizován na ribozomech
na ER, částečná glykosylace
(120 kDa)
2. transport do Golgiho aparátu,
glykosylace (160 kDa)
http://www.studyblue.com (upraveno)
4. receptorem zprostředkovaná
endocytóza pomocí klathrinem
pokrytých váčků
5. pohlcená LDL částice je
uvolněna v endozomu a receptor
se vrací na plazmatickou
membránu
3. transport na plazmatickou
membránu a vazba LDL
X
X
X
X
X
třída 3: receptor není schopen
vazby s LDL částicí
třída 5: receptor není schopen
uvolnit LDL částici v endosomu
a vrátit se na plazmatickou
membránu
třída 1: protein není syntetizován
třída 2: LDLR je částečně
nebo zcela zadržen na ER
třída 4: LDL receptor není
schopen internalizace LDL
částice endocytózou
 Záměny v LDLR proteinu nacházíme ve všech jeho doménách. Jednotlivé mutace mají různý vliv
na funkci proteinu – klasifikace do 5 tříd:
ZAVEDENÍ FUNKČNÍ ANALÝZY MISSENSE MUTACÍ
 Doplnění potvrzení kauzality dané mutace
 Objasnění vlivu mutace na funkci výsledného proteinu
 Klasifikace do příslušné třídy
http://www.studyblue.com (upraveno)
ZAVEDENÍ FUNKČNÍ ANALÝZY MISSENSE MUTACÍ
 Vytvoření mutací v genu pro LDL receptor místně řízenou mutagenezí v plazmidu
pcDNA4-LDLR-EYFP
 K usnadnění vizualizace proteinu v živých buňkách byla použita značka EYFP
(enhanced yellow fluorescence protein) na C-konci cDNA LDLR genu oddělená
sekvencí 10 aminokyselin
 LDLR plazmidy s mutací a bez mutace a s/bez EYFP značky transfekovány do
CHO (Chinese hamster ovary) buněčných linií
 Vytvořeny stabilní buněčné linie
 Laserová skenovací konfokální mikroskopie (Zeiss LSM780) k určení buněčné
lokalizace LDL receptoru
• Konkanavalin A tetramethylrhodaminový konjugát na obarvení endoplazmatického retikula
(ER)
• Anti-EEA1(early endosome antigen) + sekundární protilátka s fluor. značkou k obarvení
endozomu
• Anti-clathrin heavy chain protilátka + sekundární protilátka s fluor. značkou k obarvení
klathrinových váčků
• Inkubace s fluorescenčně značenými LDL částicemi
LDLR linker EYFP
www.microscopyu.com
MUTACE 2. TŘÍDY
Gly565Val
Endoplazmatické
retikulum
(TMR)
LDLR
(EYFP) překryv
wt
MUTACE 4. TŘÍDY
Tyr828Cys
Klathrinové váčky
(Al555)
wt
překryvLDLR (EYFP)
MUTACE 5. TŘÍDY
Endozom (Cy3) překryv
LDLR
(EYFP)
Val429Met
wt
VAZBA LDL ČÁSTIC / 3. TŘÍDA MUTACÍ
Gly565Val
wt
Val429Met
Tyr828Cys
jádro
(DAPI)
Ile161Asp
LDL
(Dil)
překryv
JEDEN ZAJÍMAVÝ PŘÍKLAD
 Sekvenční varianta Gly20Arg (mutace v signální sekvenci) - dříve považována za kauzální pro FH
 Funkční analýza ukázala, že tento receptor je schopný vázat LDL
 Jako kontrolní vytvořena mutace Leu15Pro (zničení alfa-helixu signální sekvence)
w
t
Gly20Arg
překryvLDL částice (Dil)Jádro (DAPI)
Leu15Pro
wt
Pavloušková et al., Atherosclerosis 2016
Gly20Arg
překryvER (TMR)LDL receptor (EYFP)
Leu15Pro
wt