Lenka Fajkusová Centrum molekulární biologie a genové terapie Fakultní nemocnice Brno Černopolní 9, 613 00 Brno Fajkusova.Lenka@fnbrno.cz Molekulární problematika a diagnostika vrozených nemocí •Molekulární problematika a diagnostika •neuromuskulárních nemocí • metabolických nemocí • kožních nemocí a nemocí pojivové tkáně • mentálních retardací •Analýza patogenity identifikovaných sekvenčních změn s1_spec1_f1 An external file that holds a picture, illustration, etc., usually as some form of binary object. The name of referred object is Figure_Seattle.jpg. nfig003 nfig001 •Onemocnění ….. asociovaný gen ….. kódovaný protein ….. funkce proteinu ….. vliv mutace na funkci proteinu ….. molekulární podstata onemocnění ….. klinické projevy onemocnění ….. používané metody DNA diagnostiky Disease Gene, protein Duchenne muscular dystrophy DMD, Dystrophin Spinal muscular atrophy SMN1, Survival motor neuron protein 1 Myotonic dystrophy, type 1 Myotonic dystrophy, type 2 DMPK, Dystrophia myotonia protein kinase CNBP1, Cellular retroviral nucleic acid-binding protein Limb girdle muscular dystrophy, type 2A CAPN3, Calpain-3 Facioscapulohumeral muscular dystrophy Deletion of D4Z4 repeat, 4q35 •Vybrané neuromuskulárních nemoci 1. Muscular dystrophies 5. Other myopathies 9. Metabolic myopathies 13. Hereditary ataxias 2. Congenital muscular dystrophies 6. Myotonic syndromes 10. Hereditary cardiomyopathies 14. Hereditary motor and sensory neuropathies 3. Congenital myopathies 7. Ion channel muscle diseases 11. Congenital myasthenic syndromes 15. Hereditary paraplegias 4. Distal myopathies 8. Malignant hyperthermia 12. Motor neuron diseases 16. Other neuromuscular disorders • Neuromuskulární nemoci (NMD) ØNMD narušují funkci svalu a to buď přímo v důsledku patologie svalu nebo nepřímo v důsledku patologie nervů a neuromuskulárních spojení. •780 typů NMD •417 genů •16 skupin NMD http://www.musclegenetable.fr •NMD, klinická heterogenita ØMutace v 1 genu způsobují několik typů NMD; př. LMNA, lamin A/C (tvorba jaderné laminy - síťovitá vrstva proteinů přiléhající na vnitřní stěnu vnitřní jaderné membrány). Diseases 1. Cardiomyopathy, dilated, 1A 2. Charcot-Marie-Tooth disease, type 2B1 3. Emery-Dreifuss muscular dystrophy 2, AD 4. Emery-Dreifuss muscular dystrophy 3, AR 5. Hutchinson-Gilford progeria 6. Heart-hand syndrome, Slovenian type 7. Lipodystrophy, familial partial, 2 8. Malouf syndrome 9. Mandibuloacral dysplasia 10. Muscular dystrophy, congenital 11. Muscular dystrophy, limb-girdle, type 1B 12. Restrictive dermopathy, lethal www.wikidoc.org/index.php/Dilated_cardiomyopathy http://neuromuscular.wustl.edu/time/hmsn.html http://dxline.info/diseases/charcot-marie-tooth-disease http://scientia1.files.wordpress.com/2013/01/progeria.jpg •NMD, genetická heterogenita Ø1 nemoc je způsobena mutacemi v 1 z několika genů Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy – 25 genes 2A: Calpain-3 ;15q15 2B: Dysferlin; 2p13 2C: γ-Sarcoglycan; 13q12 2D: α-Sarcoglycan; 17q21 2E: β-Sarcoglycan; 4q12 2F: δ-Sarcoglycan; 5q33 2G: Telethonin; 17q12 2H: TRIM32; 9q33 2I (MDDGC5): FKRP; 19q13 2J: Titin; 2q24 2K (MDDGC1): POMT1; 9q34 2L: ANO5; 11p14 2M (MDDGC4): Fukutin; 9q31 2N (MDDGC2): POMT2; 14q24 2O (MDDGC3): POMGnT1; 1p32 2P (MDDGC9): DAG1; 3p21 2Q: Plectin 1f; 8q24 2R: Desmin; 2q35 2S: TRAPPC11; 4q35 2T: GMPPB; 3p21 2U (Cerebellum small): ISPD; 7p21 2V: GAA; 17q25 2W: LIMS2; 2q14 2X: POPDC1; 6q21 2Y: TOR1AIP1; 1q25 http://neuromuscular.wustl.edu/musdist/lg.html#2a •Duchennova/Beckerova svalová dystrofie (DMD/BMD) R.J. Fairclough, Nature Reviews Genetics 2013 ØGen DMD, Xp21 ØDystrofin – protein membránového skeletu svalových buněk, stabilizace svalové membrány během kontrakce a dilatace svalu •DMD – nonsense mutace, delece a duplikace měnící ORF •BMD – delece a duplikace zachovávající ORF – mírnější forma nemoci DNA diagnostika: •Identifikace delecí/duplikací – MLPA (60% mutací) •Identifikace mutací malého rozsahu – PCR, sekvenční analýza exonů •DMD/BMD – diagnostika ØNutnost korelace mezi klinickými, patologickými a genetickými nálezy •Kazuistika pacienta 1 •Klinický nález: BMD •Histopatologický nález: BMD •Genetický nález: •Analýza DNA: nonsense mutace p.(Glu1110*) v exonu 25 Þ DMD ??? •Analýza mRNA: identifikace dvou transkriptů • - transkript s mutací p.(Glu1110*) • - transkript s delecí exonu 25 oLokalizace mutace c.3536C>A v sekvenci ESE Þ změna sestřihu mRNA (delece exonu 25) oDelece exonu 25 nemění ORF Þ vznik částečně funkčního proteinu Imunodetekce dystrofinu; kontrola, pacient s BMD (FNB, PAU, Hermanová M.) Reverzní transkripce-PCR •DMD/BMD – diagnostika ØNutnost spojení analýzy DNA a mRNA •Kazuistika pacienta 2 •Klinický nález: DMD •Patologický nález: DMD •Genetický nález: •Analýza DNA: bez mutace •Analýza mRNA: exon 65 – 53 nt. intronu 65 – exon 66 •Analýza DNA: c.9564-427T>G Þ inzerce pseudoexonu intron Limb girdle dystrophies: Dominant 1A: Myotilin; 5q31; Dysarthria 1B: Lamin A/C; 1q21; + Cardiac 1C: Caveolin-3; 3p25; Child onset 1D: DNAJB6; 7q36 1E: Desmin; 2q35 1F: TNPO3; 7q32 1G: HNRPDL; 4q21 Limb girdle dystrophies: Recessive 2A: Calpain-3 ;15q15 2B: Dysferlin; 2p13 2C: γ-Sarcoglycan; 13q12 2D: α-Sarcoglycan; 17q21 2E: β-Sarcoglycan; 4q12 2F: δ-Sarcoglycan; 5q33 2G: Telethonin; 17q12 2H: TRIM32; 9q33 2I (MDDGC5): FKRP; 19q13 2J: Titin; 2q24 2K (MDDGC1): POMT1; 9q34 2L: ANO5; 11p14 2M (MDDGC4): Fukutin; 9q31 2N (MDDGC2): POMT2; 14q24 2O (MDDGC3): POMGnT1; 1p32 2P (MDDGC9): DAG1; 3p21 2Q: Plectin 1f; 8q24 2R: Desmin; 2q35 2S: TRAPPC11; 4q35 2T: GMPPB; 3p21 2U (Cerebellum small): ISPD; 7p21 2V: GAA; 17q25 2W: LIMS2; 2q14 2X: POPDC1; 6q21 2Y: TOR1AIP1; 1q25 http://neuromuscular.wustl.edu/musdist/lg.html#2a http://mda.org/disease/limb-girdle-muscular-dystrophy/causes-inheritance 7 LGMD s AD typem dědičnosti (LGMD1A-G); 25 LGMD s AR typem dědičnosti (LGMD2A-S) •Pletencové svalové dystrofie (LGMD) Počet pacientů s LGMD zaslaných k analýze 218 •LGMD2A, CAPN3, calpain-3; počet pacientů s mutací: 71 (32,6%) •LGMD2I, FKRP, fukutin related protein; počet pacientů s mutací: 9 (4,1%) •LGMD2D, SGCA, alpha-sarcoglycan; počet pacientů s mutací: 6 (2,8%) •LGMD2L, ANO5, anoctamin 5; počet pacientů s mutací: 3 (1,4%) Diagnóza potvrzena u 40,8% pacientů. Western blot kalpainu-3; imunohistochemická detekce alfa-sarkoglycanu (kontrola, pacient s LGMD2D). (FNB, PAU, Hermanová M.) Pacient s podezřením na LGMD2 – který gen analyzovat? •LGMD – diagnostika Výběr genů na základě četnosti výskytu mutací v jiných populacích? Limb girdle dystrophies: Dominant 1A: Myotilin; 5q31; Dysarthria 1B: Lamin A/C; 1q21; + Cardiac 1C: Caveolin-3; 3p25; Child onset 1D: DNAJB6; 7q36 1E: Desmin; 2q35 1F: TNPO3; 7q32 1G: HNRPDL; 4q21 Limb girdle dystrophies: Recessive 2A: Calpain-3 ;15q15 2B: Dysferlin; 2p13 2C: γ-Sarcoglycan; 13q12 2D: α-Sarcoglycan; 17q21 2E: β-Sarcoglycan; 4q12 2F: δ-Sarcoglycan; 5q33 2G: Telethonin; 17q12 2H: TRIM32; 9q33 2I (MDDGC5): FKRP; 19q13 2J: Titin; 2q24 2K (MDDGC1): POMT1; 9q34 2L: ANO5; 11p14 2M (MDDGC4): Fukutin; 9q31 2N (MDDGC2): POMT2; 14q24 2O (MDDGC3): POMGnT1; 1p32 2P (MDDGC9): DAG1; 3p21 2Q: Plectin 1f; 8q24 2R: Desmin; 2q35 2S: TRAPPC11; 4q35 2T: GMPPB; 3p21 2U (Cerebellum small): ISPD; 7p21 2V: GAA; 17q25 2W: LIMS2; 2q14 2X: POPDC1; 6q21 2Y: TOR1AIP1; 1q25 http://neuromuscular.wustl.edu/musdist/lg.html#2a http://mda.org/disease/limb-girdle-muscular-dystrophy/causes-inheritance 7 LGMD s AD typem dědičnosti (LGMD1A-G); 25 LGMD s AR typem dědičnosti (LGMD2A-S) •LGMD ØSequence Capture (SeqCap EZ Choice Library; NimbleGen) ØCílená sekvenace (MiSeq, NextSeq; Illumina) Ø •Zadání cílových úseků, design sond •Příprava knihovny - fragmentace DNA •Hybridizace fragmentované DNA se sondami s navázaným biotinem •Vychytání sond s navázaným fragmentem DNA pomocí magnetických kuliček s navázaným streptavidinem •Amplifikace •Sekvenace •DNA diagnostika NMD pomocí NGS nfig001 •K expanzi mikrosatelitních repetic dochází v 5´netranslatovaných oblastech, exonech, intronech, 3´netranslatovaných oblastech. •Spinocerebellar ataxias (SCA12), Spinal Bulbar Muscular Atrophy (SBMA), myotonic dystrophy (DM) • Nemoci způsobené expanzí mikrosatelitních repetic •K. Usdin, Genome Res. 2008 ØExpanze CTG repetice v 3’UTR genu DMPK (19q13, dystrophia myotonica protein kinase); AD dědičnost •38-50 repetic: premutace, bez klinických projevů •50-150 repetic: mírná „adult-onset“ MD1 (katarakta, diabetes, mírná svalová slabost, myotonie) •100-1000 repetic: klasická MD1 •>1000 repetic: kongenitální MD1 (respirační selhání, svalová slabost, deformity nohou) ØDynamická mutace – počet repetic se může zvětšovat při přenosu do dalších generací. • Myotonická dystrofie typu 1 (MD1) File:Myotonic dystrophy patient.JPG http://neuromuscular.wustl.edu/pics/people/patients/DM1cataractvsm.jpg http://neuromuscular.wustl.edu/musdist/pe-eom.html http://medgen.genetics.utah.edu/photographs/diseases/low/421.jpg http://medgen.genetics.utah.edu/photographs/pages/myotonic_dystrophy.htm http://cnx.org/content/m14898/latest/ Cause_DM2_image(1) • Myotonické dystrofie ØMD1 •Expanze CTG repetice v 3’UTR genu DMPK (19q13, dystrophia myotonica protein kinase) •AD dědičnost ØMD2 •Expanze CCTG repetice v 1. intronu genu CNBP1 (3q21, Cellular retroviral nucleic acid-binding protein) •AD dědičnost •Pacienti s MD1/MD2 Þ exprese genů s expanzemi CTG/CCTG •Tvorba jaderných struktur, které obsahují RNA s expanzemi CUG/CCUG Þ místo vazby RNA-vazebných proteinů (proteiny regulující sestřih mRNA – MBNL1 protein) Þ nedostatek RNA-vazebných proteinů v místech jejich fyziologické funkce •Změny sestřihu – chloridový kanál CLCN1, …….. •Změny sestřihu mRNA genu CLCN1 Þ nedostatek proteinu CLCN1 Þ myotonie cell_a cell_b •Myotonic dystrophy is caused by the binding of a protein called Mbnl1 to abnormal RNA repeats. In these two images of the same muscle precursor cell, the top image shows the location of the Mbnl1 splicing factor (green) and the bottom image shows the location of RNA repeats (red) inside the cell nucleus (blue). The white arrows point to two large foci in the cell nucleus where Mbnl1 is sequestered with RNA. Photos by Hongqing Du •Molekulární patofyziologie MD1 a MD2 tileshop •Model regulace setřihu CLCN1: 5´konec exonu 7A – lokalizace sekvence exon splicing enhancer (ESE). MBNL1 se váže k ESE a potlačuje zařazení exonu 7A do mRNA. Přítomnost expanze CUG/CCUG vede k nedostku MBNL1 a začlenění exonu 7A do mRNA. Exon 7A obsahuje předčasný terminační kodón Þ rozklad mRNA procesem nonsense mediated mRNA decay. Y. Kino, Nucleic Acids Res 2009 •Molekulární patofyziologie MD1 a MD2 •Svalová ztuhlost a neschopnost relaxace svalu po kontrakci •Gen CLCN1 (7q35), muscle chloride channel 1 •Mutace spojené s AR i AD typem dědičnosti •Funkční protein CLCN1– homodimer •D. R. Rayan, 2013 nfgz002 • Myotonia congenita, CLCN1 Réblová K., PLoS One 2013 ØCLCN1: homodimer, každá podjednotka vytváří Cl- pór. •Heterozygoti (1 standardní CLCN1/1 mutantní CLCN1) - 25% standardních kanálů, 25% kanálů obsahujících dvě mutantní podjednotky, 50% kanálů obsahujících jednu standardní a jednu mutantní podjednotku (heterodimer) •Dominantní MC je způsobena dominantně-negativním efektem mutantní podjednotky vůči standarní v heterodimeru Standardní CLCN1 CLCN1 s mutací • Myotonia congenita, CLCN1 •PTC (předčasný terminační kodón) mutace – recesivní MC •Missense mutace – recesivní nebo dominantní MC – souvislost s lokalizací v CLCN1 dimerní struktuře •p.(Glu291Lys) – recesivní dědičnost; změna náboje – závažný efekt na strukturu proteinu Þ „misfolding“ a degradace proteinu •p.(Glu291Asp) – dominantní dědičnost; zachování negativního náboje – mírný efekt na strukturu proteinu, tvorba dimeru, dominantně negativní efekt mutace v heterodimeru • • Myotonia congenita, CLCN1 •Glutámová kys. Réblová K., PLoS One 2013 •Lysin •Asparagová kys. •AD dědičnost •Delece makrosatelitní repetice D4Z4 v subtelomerní oblasti 4q35 •Velikost repetice D4Z4: 3,3 kb [USEMAP] An external file that holds a picture, illustration, etc., usually as some form of binary object. The name of referred object is Figure_Seattle.jpg. •Facioskapulohumerální svalová dystrofie, FSHD •Standardní DNA: •11-100 D4Z4 •(36-330 kb) • Pacienti s FSHD: •1-10 D4Z4 •(<33 kb) •Byly identifikovány dvě alelické varianty 4q35: 4qA and 4qB •FSHD je spojena s delecí D4Z4 na chromozomu 4qA (FSHD) F1 •FSHD ØD4Z4 repetice, 290 CpG dinukleotidů – potenciální kandidáti pro metylaci DNA (modifikace DNA asociovaná s kondenzací chromatinu a umlčením exprese) •FSHD - epigenetika ØFSHD je spojena se změnami metylace DNA a histonové modifikace repetice D4Z4. •Standardní alela: metylace DNA, H3K9me3 (heterochromatin) •FSHD alela: DNA hypometylace, H3K9me3 ↓ (modifikace jsou jen na alele 4q35 s delecí D4Z4) •Repetice D4Z4 – gen DUX4 (exon 1 a 2). FSHD chromozomy (delece D4Z4 na 4qA) – exprese DUX4; poslední repetice D4Z4 – přepis DUX4 včetně polyadenylačního signálu (stabilizace mRNA) Þ protein DUX4 Þ apoptóza svalových buněk S.M. van der Maarel, Trends in Molecular Medicine 2011 rflp • Pacienti s FSHD: detekce fragmentu < 10 repetic D4Z4 •(<33 kb) • Standardní DNA: detekce fragmentu > 11 repetic D4Z4 (36-330 kb) •FSHD – diagnostika