Elektroforéza nukleových kyselin Elfo nukleových kyselin • Elektroforéza nukleových kyselin je založena na tom, že NK jsou v neutrálním nebo zásaditém prostředí polyanionty. • Pohyblivost DNA při elektroforéze je závislá na elektrickém náboji (Q) a frikčním koeficientu (ξ). Oba parametry jsou přímo úměrné velikosti molekuly • Se zvyšujícím se počtem nukleotidů (zvyšující se molekulovou hmotností) v molekule DNA (RNA) úměrně roste i náboj molekuly, poměr mezi molekulovou hmotností a nábojem je konstantní. Konstantní je i poměr mezi celkovým nábojem a frikčním koeficientem; m0 = Q/ξ = 2 x 10-4 cm2/Vs, kde m0 je mobilita DNA ve volném roztoku. • Tento fakt znemožňuje účinné rozdělení nukleových kyselin ve volném roztoku na základě jejich velikosti. • Elektroforéza NK se proto provádí na vhodném nosiči – a to i z praktických důvodů (snadná manipulace, stálost získaného rozdělení apod.). • Časem se jako nosiče nejlépe osvědčily agarosa a polyakrylamid. Agarosa a polyakrylamid Agarosa je získávána z mořských řas. Je to lineární polysacharid, jehož základní strukturní jednotka je složena z D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy. Průměrná velikost molekuly agarosy činí 300-400 základních jednotek Polyakrylamidový gel vzniká polymerací akrylamidu s příměsí bisakrylamidu, který umožňuje zesíťování lineárních vláken a vytvoření prostorové struktury. Pro proběhnutí reakce je třeba APS a TEMED. Výhody a nevýhody agarosového a polyakrylamidového gelu • Agarosový gel – Snadná příprava – Velké rozmezí velikostí molekul DNA, které je možné na agarose dělit – Vysoká cena – Přírodní produkt, jednotlivé šarže i od stejného výrobce se mohou trochu lišit a poskytovat odlišné výsledky. – DNA izolovaná z agarosového gelu může být kontaminovaná látkami (např. sacharidy, ionty kovů), které mohou inhibovat následně prováděné reakce (restrikční štěpení). • Polyakrylamidový gel: – Pracnější příprava – Třeba dávat větší pozor při manipulaci, protože akrylamid a N,N´metylenbisakrylamid jsou vysoce toxické a kumulují se v organismu – Vysoká rozlišovací schopnost (0,2%), tj. dokáže rozlišit např. DNA o délce 500 bp od DNA 501 bp – Dokážou pojmout mnohem větší množství DNA než agarosové gely bez ztráty rozlišení – DNA izolovaná z polyakrylamidového gelu je vysoce čistá a může být použita i pro velmi náročné molekulárněbiologické techniky (např. mikroinjekce DNA do myších embryí). Schematický diagram závislosti mobility DNA na velikosti její molekuly • Tři různé režimy dělení molekul: 1. Ogstonovo síto 2. Plazení bez napínání 3. Plazení s napínáním • Rg - gyrační poloměr molekuly DNA • a – průměrná velikost pórů agarosového gelu Závislost elektroforetické pohyblivosti DNA vzhledem k velikosti její molekuly Rozmezí efektivní separace fragmentů DNA v polyakrylamidovém a agarosovém gelu Příprava horizontálního agarosového gelu Aparatura pro polakryamidovou gelovou elektroforézu Běžně používané elektroforetické pufry • Elektroforetická mobilita DNA je ovlivněna složením a iontovou silou elektroforetického pufru. • V nepřítomnosti iontů je elektrická vodivost velmi nízká a DNA putuje velmi pomalu, bendy jsou rozmazané. • Pokud použijeme pufr o vysoké iontové síle, vodivost je vysoká a vyvíjí se velké množství tepla. Může dojít k roztavení agarosového gelu nebo k denaturaci DNA. • Často používaný TAE má menší pufrační kapacitu než TBE nebo TPE. Nanášecí pufry pro elektroforézu • Nanášecí pufry plní tři role: – Zvyšují hustotu nanášeného vzorku, který ochotněji klesá ke dnu startu. – Svou barvou usnadňují nanášecí proces. – Během elektroforézy indikují přibližnou polohu jednotlivých fragmentů DNA. BPB migruje v 0,5 x TBE asi jako lineární DNA 300 bp dlouhá, XC přibližně jako 4 kb. Barvení gelu• Klasickým činidlem používaným k obarvení gelu je ethidiumbromid (2,7-diamino-10ethyl-9-fenyl-fenanthridinium bromid). • V současnosti jsou k dispozici i další činidla (SYBR Green I). • Fluorescenční výtěžek komplexu SYBR GreenI/DNA je více než 5x vyšší než komplexu EtBr/DNA • Detekce dsDNA je velmi citlivá – SYBR Green I dokáže detegovat méně než 20 pg (60 pg) DNA v jednom elfo proužku při použití 254 nm (300 nm) UV záření (25x vyšší citlivost než v případě EtBr) • Citlivá detekce oligonukleotidů – téměř 100x citlivější než EtBr • Snadné použití – snížené pozadí v nepřítomnosti DNA v porovnání s EtBr, to umožňuje vynechat odbarvovací krok. • Snadno se odstraňuje z dsDNA přesrážením etanolem. • Nízká koncentrace SYBR Green I používaná při barvení většinou nijak významně neinhibuje restrikční štěpení. • Barvení stříbrem – polyakrylamidové gely • Radioaktivita • Kovalentně navázané fluorescenční sloučeniny Dokumentace gelu ozářeného ultrafialovým světlem • Horní obrázek znázorňuje uspořádání zdroje UV záření, gelu a fotoaparátu, při kterém je zdroj UV záření umístěn pod gelem a DNA je zviditelněna procházejícím zářením. • Spodní obrázek ukazuje sestavu, při které je pro vizualizaci DNA použito odražených UV paprsků. 1. Standardy: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000. 250 bp 500 bp 1000 bp 1500 bp 2000 bp 3000 bp 6000 bp 10 000 bp Denaturační polyakrylamidové gely – BPB a XC jako indikátory efektivního rozdělení • Denaturační polyakrylamidové gely se používají např. při sekvenaci DNA. • Jako denaturační činidlo se používá močovina nebo, méně často, formamid. • Aplikuje se vysoké napětí, elektroforéza se provádí při zvýšené teplotě (50°C). Za těchto podmínek je omezena tvorba sekundárních struktur DNA, DNA zůstává jednořetězcová, natažená v lineární formě, rozdělení je podle velikosti molekul. Sekvenační gely Sekvenační gel • Dráha č: 1. 6,6 kb 2. 9,4 kb 3. 13,0 kb 4. 14,0 kb 5. 23,1 kb 6. 41,7 kb 7. 170 kb Porovnání rozlišovací schopnosti u kontinuální (A) a pulsní (B) elektroforézy Porovnání rozlišovací schopnosti u kontinuální (A) a pulsní (B) elektroforézy Pulsní elektroforéza – provedení PFGGE • PFGGE (pulsed field gradient gel electrophoresis) – první pokus o rozdělení velkých molekul DNA (1984) • Elektrické pole v tomto provedení není homogenní, tomu odpovídá i rozložení molekul DNA v různých startech. • Je velice obtížné, ne-li nemožné porovnávat vzorky v jednotlivých drahách. Jiná varianta PFGGE Uspořádání pulsní gelové elektroforézy – OFAGE a TAFE • OFAGE (orthogonal field alteration gel electrophoresis) • TAFE (transverse alternating field electrophoresis) Pulsní elektroforesa – uspořádání CHEF a crossed field • CHEF (clamped homogeneous electric field) Pulsní elekroforesa – uspořádání PHOGE a FIGE • PHOGE (pulsed homogeneous orthogonal field gel electrophoresis) • FIGE (field inversion gel electrophoresis) Mezi faktory ovlivňující efektivní rozdělení dlouhých molekul DNA patří u pulsní gelové elektroforézy kromě napětí také doba pulsu • Empirický vztah Nmax = 1,08 x T x (U/d)1,44 – Nmax….největší molekula DNA separovaná při dané době pulsu – T……..doba pulsu – U……..napětí – d……..vzdálenost elektrod Zóny identifikovatelné pulsní elektroforézou • Typický gel získaný technikou pulsní gelové elektroforézy obsahuje 4 zóny: 1. Tato zóna zahrnuje malé molekuly DNA (0,2 – 20 kb), lze je separovat klasickou elfo. 2. V této zóně se nacházejí molekuly které již nelze rozdělit klasickou elfo, konkatemery fága l (dráha A) lišící se navzájem o jeden genom jsou děleny téměř lineárně než je dosaženo inflexního bodu i. 3. V zóně 3 je dosaženo značně zvýšeného rozlišení s maximální separací sousedících konkatemerů fága l. S rostoucí velikostí molekul v této zóně dochází rychle ke snížení separace a rozlišení. 4. Kompresní zóna obsahuje všechny molekuly, které jsou dostatečně malé na to, aby vstoupily do gelu, ale příliš velké, než aby je bylo možné za daných podmínek rozlišit. V této zóně často dochází k „předběhnutí“ menší molekuly molekulou větší. A - konkatemery fága l B - chromozomy S. cerevisiae, kmen ZPH149 C - chromozomy S. cerevisiae, kmen YNN295 D - chromozomy S.pombe Rozdíly mezi sc, lineární a relaxovanou (oc) formou • Gelovou elektroforesou můžeme dělit DNA nejen podle velikosti, ale také podle tvaru. • Existují tři základní formy DNA: – scDNA – ocDNA – lineární DNA • ocDNA migruje vždy nejpomaleji. • U sc a lineární formy DNA jejich pořadí závisí na hustotě gelu a napětí. • V řidších gelech a při nižším napětí se více uplatňuje kompaktnost scDNA, v hustších gelech a při vyšším napětí získává navrch lineární forma DNA vzhledem k její vyšší flexibilitě. 1 2 3 4 Rozdělení topoisomerů v agarosovém gelu • Na uvedeném obrázku jsou rozděleny jednotlivé topoizomery lišící se počtem superhelikálních závitů. Jednotlivé proužky odpovídají molekulám plsmidové DNA o stejné velikosti, ale lišící se superhelikální hustotou. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15