Souhrn předchozích přednášek (IS)
• Genetické metody
– mutageneze/“screen“
– komplementace
– identifikace
• Buněčný cyklus
– Průběh a regulace BC
– Synchronizace buněk
– Mechanismy regulace párování - transkripce
– Homothalické kmeny
Cvičení: 8. a 15.12., A7 (2.17) - pláště, psací a kreslící potřeby
sekrece
Osnova přednášky
• Regulace transkripce
– Gal4 transkripční faktor
• transkripční hybridní systémy
– alternativní kvasinkové systémy
• hybridní – G-proteiny
• komplementační – DHFR, ubikvitin
biotechnologie
Regulace transkripce v haploidních buňkách
(konstitutivní)
a1, a2 + α1, α2 - transkripční faktory, které ovlivňují transkripci 3 skupin genů
a-spec.= MFA1,2 (a-feromon), STE2 (α-receptor), STE6, 14 (úprava a sekrece feromonu)
α-spec.= MFα1,2 (α-feromon), STE3 (a-receptor), STE13, KEX2 (proteasy)
haploid spec.= STE4,18 (podjednotky G-proteinu), RME1 (inhibitor meiosy)
aSG ON
αSG OFF
haploid SG ON
MAT lokus Typ buňky Geny kontrolované MAT lokusem
a haploida1, a2
α haploidα1, α2 aSG OFF
αSG ON
haploid SG ON
α2
α1
diploidα1, α2
a1, a2
aSG OFF
αSG OFF
haploid SG OFF
α2
α1
α2a1
α haploidα1, α2 aSG OFF
αSG ON
haploid SG ON
α2
α1
Struktura promotorů
Kvasinkové promotory se liší od bakteriálních a vyšších eukaryot (kvasinky
netranskribují z takových promotorů – kvasinkové plasmidy …)
-Většina míst pro iniciaci transkripce obsahuje TC(G/A)A a PuPuPyPuPu
(specifické pro kvasinky)
- TATA box (TATAT/AAT/A) je 60-120bp od iniciačního místa (podobné Pribnowovu
boxu u bakterii)
- UAS (upstream activating sequences) a URS (upstream repressing sequences)
- DAS (downstream activating sequences – přímo v sekvenci genu)
Represor
na URS
Aktivátor
na UAS
konstitutivní
- Pouze GAL5 gen je konstitutivně exprimován (potřebný pro metabolismus glukózy)
- všechny ostatní jsou indukovány růstem na galaktóze a reprimovány glukozou
- GAL1, GAL7 a GAL10 geny jsou v klastru na chromosomu 2
- GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS těchto genů
Regulace metabolické dráhy galaktózy
genetický
screen na
gal mutanty
Různé kvasinky využívají různe cukry (viz přednáška o určování kvasinek)
Johnston et al., MCB, 1994
- glukosa reprimuje transkripci GAL genů na různých úrovních
- URS v promotorech GAL1 genu
- reprimuje transkripci GAL4 transkripčního aktivátoru
- reprimuje GAL3 induktor a GAL2 permeasu
aktivátor
inhibitor Gal4p
induktor
Regulace transkripce GAL genů
- GAL1, GAL7 a GAL10 geny jsou v klastru na chromosomu 2
- GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS těchto genů
- Gal80p se váže na Gal4p a reprimuje/inhibuje transkripci
- Gal3p induktor se váže na Gal80p a blokuje jeho vazbu na Gal4p
- GAL1 promotor je rychle indukovaný a velmi silný – 1000x se zvýší mRNA (až 1%)
- používá se pro overexprese/nadprodukce proteinů
- nesmí být přítomna glukosa !
Uetz and Finley, 2005
Regulace
transkripce
GAL genů
Ren et al., Science, 2000
ChIP Gal4p
microarray po galaktose
FUR4 zvyšuje množství uracilu pro UDP-Gal
MTH1 potlačuje transport glukosy (zlepšuje příjem gal)
PCL10 potlačuje glyconeogenezi (maximalizuje zisk z gal)
Transkripční aktivátor Gal4p
UAS
Luban a Goff, CO Biotech, 1995
Ptashne a Gann, Science, 1997
Vznik 1-hybridních systémů
- Takto funguje např. i FASAY (Functional Analysis of Separated Alleles in Yeast)
pro testování mutantních p53 (transkripční faktor)
Různé transkripční faktory mají podobné domény a lze je kombinovat …
Lze hledat DNA-vazebné proteiny pro danou UAS sekvenci (AD-hybridní knihovny)
Grochová et al., Oncology Reports, 2008
mut p53 (duplikace 30bp)
kvasinka opravila
Ade2 reporter genUAS
transkripcep53
wt
Ade2 reporter genUAS
p53
mut
- stanovení aberací p53 v klinickém materiálu - imunoanalýza, FISH, sekvenace
p53
- určení funkčního statutu - stanovení transaktivačích schopností p53 metodou
FASAY (functional analysis of separated alleles in yeast) - stanovení
transaktivačních vlastností p53 prostřednictvím speciálně upraveného
kvasinkového kmene Saccharomyces cerevisiae yIG397
Analýza funkčních vlastností p53
Grochová et al., Oncogene, 2008
test teplotní sensitivity
test promotorů
luciferáza
D-luciferin + O2 oxyluciferin + světlo
Toxikologické aplikace
RECETOX/CETOCEON
(Dr. Čupr/prof. Holoubek)
Bartos et al, Env Tox, 2006
V tomto systému byly
testovány různé polutanty –
efekt na „estrogenní“ dráhu
UAS
Luban a Goff, CO Biotech, 1995
Ptashne a Gann, Science, 1997
Vznik 2-hybridních systémů
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
BD a AD domény lze zaměnit
plasmid
(TRP1)
plasmid
(LEU2)
velmi citlivý (3AT)
velmi stringetní
semikvanitativní (β-gal)
Gal4 systém
různé promotory
Klasický Y2H systém
Nejčastěji používaný kmen PJ69-4a
2-hybridní systém
His3
His3
His3
kvantitativní
auxotrofie
(media bez …)
FACSorting
rezistence
(media s aureob)
Reportérové geny
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
Nature (2000) p. 623
Y
X
DBD
AD
Mat a buňky
8x12 jamek
(96 na misku)
Všechny ORF
Mat α buňky
Y
X
Reporter genGAL1 UAS
transkripceDBD
AD
Kvasinkový „INTERACTOME“
Místo transformací dvou plasmidů do
jedné buňky byly BD plasmidy v α
buňkách a AD v a buňkách –
párováním byly vytvořeny jejich
kombinace
Alternativní jaderné systémy
Pokud BD konstrukt „auto-aktivuje“ RNA pol II:
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
T138 rozpoznávaná
sekvence je nahrazena
Gal4 promotorem
RNA pol III má odlišný mechanismus aktivace
snr6-A62G mutace je teplotně sensitivní (potlačení ts hybridním systémem)
Tup1 je represor, „auto-aktivace je blokována Tup1 represorem (využití
5-FOA pro „pozitivní“ detekci interakce – viz reverzní systémy)
Reversní systém (Y2H)
- při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou
kyselinu (5-FOA) k negativní selekci tj. interakce povede k záhubě
kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách
porostou (mutanty nebo syntetické látky) TIBTECH (1999) p. 374
Split-hybrid systém
Shih et al, PNAS, 1996
represor
bez represoru
Klasický dvoj-hybridní systém
Troj-komponentní (dvoj-H) systém
– heterotrimerní proteinové komplexy
- posttranslační modifikace
Dvoj-hybridní systém
- proteinový inhibitor interakce
Troj-hybridní systém
– RNA interakce
- ligand/receptor
Hybridní RNA molekula
Tři různé proteiny
spolu vytváří stabilní
komplex (Nse3
propojuje
Nse1 a Nse4)
Analýza vazby protein-RNA (Y3H)
SenGupta et al, PNAS, 1996
Tři hybridní/fůzní konstrukty:
1. DB-Gal4 a RNA-vazebný protein (MS2 virový coat protein)
2. RNA molekula složená z TAR (HIV trans-activation response element) a MS2
sekvence
3. AD-Gal4 a trans-activation protein Tat (váže TAR)
Vazba ligand-receptor (Y3H)
FK506
Licitra et al, PNAS, 1996
dexamethasone
Tři hybridní/fůzní konstrukty:
1. DB-Gal4 a glukokortikoid receptor
(váže dexamethason)
2. Organická sloučeniná obsahující
dexamethason a FK506 (v médiu)
3. AD-Gal4 a FKBP12 (váže FK506)
CytoTrap 2-hybridní systém
Kvasinkový cdc25-2 ts mutant – lidský hSOS (guanine exchange factor) aktivuje
RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti
- jeden partner je myristylován (signální sekvence) a ukotven na membránu a druhý
(interakční) partner je fuzován k hSOS – spustí Ras dráhu (roste i na vyšší teplotě)
Broder et al, Cur Biol, 1998
alternativní G-protein hybridní systémy
Kvasinkový ste18∆ mutant nereaguje na αferomon
– Ste18p fůzovaný s jedním
partnerem a druhý je ukotvený na
membráně - silná interakce nedovolí
asociaci Ste18 a Ste4 a nespustí se signální
dráha (buňky rostou za přítomnosti αferomonu,
nespustí reportér)
Ste18
Ste4
Ste18 Ste4
vhodný pro analýzu disrupce
Komplementace proteinů
Aktivní DHFR (dihydrofolat
reduktasa) je vytvořena
propojením dvou separovaných
částí enzymu (přes interakci
fůzovaných proteinů) – odbourává
pro kvasinky toxický methotrexát
Tarrasov et al, Science, 2008
Johnsson et al, PNAS, 1994
Stynen et al, MMBR, 2012
Komplementace proteinů
Interakcí dvou partnerů dochází ke komplementaci
eGFP na povrchu kvasinkové buňky (ukotveno
pomocí fůze s Aga2 aglutininem) – buňky mohou být
vytříděny pomocí FACS
Interakcí dvou partnerů dochází
ke komplementaci ubikvitinu –
původní verze založena na
Western blot detekci –
adaptováno pro kvasinky se
selekcí na klasickém principu
(reportérového genu)
Bruckner et al, IJMS, 2009
Přehled kvasinkových PPI biotechnologií