Protoplasty kvasinek jako
modelový objekt
1. Historie objevu modelu protoplastů
2. Metody přípravy protoplastů
3. Metody regenerace buněčné stěny u
protoplastů
4. Fuze protoplastů
5. Genetická transformace kvasinek na modelu
protoplastů
6. Sexuální hybridizace u protoplastů
1. Historie objevu
• Protoplasty rostlinných buněk (Klebs 1887,Townsend 1897)
• Sféroplasty, L-formy a protoplasty bakterií (Weibull
1953, Dienes 1939, Kandler, 1954)
• O.Nečas a plasmatické koule kvasinek (Nečas 1954)
• Autolytické protoplasty (Nečas 1955)
• Protoplasty připravené lýzou b. stěny helikázou
(Eddy a Wiliamson,1959)
• Regenerace protoplastů v gelech (Nečas, 1962,
Svoboda 1966)
2.Metody přípravy protoplastů
• Mechanické rozbití kvasinkových buněk v hypertonickém
roztoku
• Autolýza buněčné stěny
• Aplikace enzymů lyzujících buněčnou stěnu
– Výběr osmotika - sorbitol, mannitol, KCl, MgSO4 a koncentrace
– Aplikace látek rušících S-S vazby v buněčné stěně –
merkaptoetanol,dithiothreitol aj
Buňky a čerstvě
vytvořené protoplasty
Saccharomyces cerevisiae
Trigonopsis variabilis
Růst protoplastů v tekutém mediu nebo na povrchu agarových filmů: jádra se dělí,
cytoplasma vytváří vakuolizované útvary.
Regenerace buněčné stěny na povrchu
protoplastů při kultivaci v tekutém mediu a v gelu
Tvar rostoucího protoplastu je není určován
regenerující buněčnou stěnou, ta jen
modifikuje morfologii rozpínající se cytoplasmy
Regenerace
protoplastů v
želatinovém
gelu
Morfologie regenerace protoplastů v agarovém gelu
Regenerace protoplastů v polyethylenglykolovém mediu
Protoplasty některých
kvasinek mohou
regenerovat na agarových
filmech nebo i v tekutém
mediu
Aglutinace protoplastů ve 40% polyethylenglykolu a vytváření polyprotoplastů po
zředění živným mediem
Povrchy agregovaných
protoplastů ve 40% PEG
Lokální poruchy struktury
plasmatické membrány po
inkubaci protoplastů ve
40% PEG 30 min při 370 C
Aplikace protoplastů kvasinek v
buněčné biologii a genetice
• 1. Studium funkce buněčné stěny
mechanická bariéra
signální funkce – recepce stresových faktorů, feromonů aj
regenerační schopnosti buňky
syntéza komponent buněčné stěny
• 2. Studium struktury plasmatické membrány
• 3. Studium nepohlavní hybridizace kvasinek
vnitrodruhová a mezidruhová hybridizace
• 4. Transformace kvasinek
Protoplasty S.c.
α + a, pouze
neorientovaný
růst, žádná fuze
α protoplasty +
a buňky:
párovací
výběžky tvoří
pouze buňky
Orientovaný růst
buněk směrem k
rostoucímu
protoplastu –
žádná fuze
Mezidruhová fuze S.cerevisiae his- x S.pombe trp-