PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction kit Izolační protokol Reagencie: PrepFiler® BTA Forensic DNA Lysis Buffer 1.0 M roztok DL-Dithiothreitolu (DTT) Proteináza K PrepFiler® Lysis Buffer Prepfiler® Magnetic Particles Isopropanol Prepfiler® Wash Buffers A a B Prepfiler® Elution Buffer Spotřební plastik: 2 ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem 1,5 ml zkumavky Laboratorní vybavení: Pipety Špičky s filtrem Vortex Mikrocentrifuga Thermoshaker 16ti jakmový magnetický stojan Před izolací: * Inkubujte magnetické částice 37ºC po dobu deseti minut, rozsuspendujte a před použitím zkumavku obraťte tam a zpět * Pokud se v PrepFiler® BTA Forensic DNA Lysis Buffer objeví sraženiny, inkubujte při 37ºC po dobu patnácti minut a krátce zvortexujte * Do Prepfiler® Wash Buffer A přidejte 93 ml 95% etanolu a označte na lahvičce * Do Prepfiler® Wash Buffer B přidejte 19, 5 ml 95% etanolu a označte na lahvičce Použitelnost pufrů je 6 měsíců od data ředění. Postup izolace 1. Zhřejte thermoshaker na 56 ºC 2. Do zkumavky nasypte 100 mg kostního prášku. 3. Připravte lyzační směs dle návodu a zvortexujte. Komponenta Objem (1 reakce) PrepFiler® BTA Lysis Buffer 220 μl 1.0 M DTT 3 μl Proteináza K 7 μl 4. Přidejte lyzační pufr ke vzorku. 5. Pečlivě uzavřete a 5 vteřin centrifugujte, poté velmi jemně zvortexujte. 6. Umístěte do thermoshakeru a při 56 ºC a 1100 rpm inkubujte 24 hodin. 7. Nechte zchladnout zkumavky se vzorky na pokojovou teplotu a centrifugujte 90 vteřin na 10 000g. Poté lyzát bez sedimentu přemístěte do čisté mikrozkumavky. Lyzát lze po tomto kroku uchovat dobu jednoho týdne při -80 °C. 8. Přidejte 300 μl PrepFiler® Lysis Buffer k lyzátu, krátce vortextuje. 9. Zvortexujte Prepfiler® Magnetic Particles. Správnou rozsuspendaci si ověřte otočením zkumavky. 10. Napipetujte 15 μl magnetických částic do lyzátu, uzavřete zkumavku, a velmi pomalu vortexujte (500 – 1200 rpm) po dobu deseti sekund. Krátce centrifugujte. 11. Přidejte 300 μl izopropanolu (99,5% , čistota molecular biology grade), velmi pomalu vortexujte (500 – 1200 rpm) po dobu deseti sekund. Krátce centrifugujte. 12. Umístěte do thermoshakeru a při pokojové teplotě a 700 rpm inkubujte deset minut. 13. Pokud nějaké částice ulpěly na stěnách zkumavky, spláchněte je do lyzátu. 14. Vortexujte 10 sekund vzorek na maximum. 15. Umístěte zkumavky se vzorky do magnetického stojanu a deset minut nechte nasedat magnetické částice. 16. Odsajte všechnu vodnou fázi. 17. Promývejte Prepfiler® Wash Buffer A Prepfiler® Wash Buffers A Prepfiler® Wash Buffers B 600 μl 300 μl 300 μl a) Zavřete zkumavky a vyndejte z magnetického stojánku. b) Vortexujte 15 sekund a poté krátce centrifugujte. c) Umístěte do magnetického stojánku na 1 minutu d) Odsajte všechnu vodnou fázi. 18. Krátce centrifugujte a umístěte opět zkumavku do stojánku. Nízkoobjemovou pipetou odsajte zbytek tekutiny. 19. Pokud je stále přítomno reziduum tekutiny, umístěte zkumavku do magnetického stojanu, otevřete víčko a nechce vysušit. 20. Zahřejte thermoshaker na 70 ºC. Přidejte 50 μl Prepfiler® Elution Buffer a vortexujte na maximum dokud se pelet nerozsuspenduje. 21. Umístěte do thermoshakeru a při 70 ºC a 900 rpm inkubujte po dobu deseti minut. 22. Vortexujte na maximum dokud se magnetické částice zcela nezmizí ze stěn zkumavky. 23. Umístěte do magnetického stojánku, dokud se všechny magnetické částice nenalepí na stěnu. 24. Odsajte pipetou veškerou tekutinu, která obsahuje izolát do přichystané mikrozkumavky. 25. Uchováváme při -20 ºC