Základy práce s aDNA - sekvenování

·        Vizualizace produktů PCR gelovouelektroforézou na 3% agarózovém gelu (Agarose, low gelling
temperature, Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA):

10 μl produktu PCR + 5 μl Gel Loading Solution (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)

Do první jamky gelu 10 μl DirectLoad^™ 50 bp DNA Step Ladder (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)

ladder





      PK

        NK


·        Přečištění produktů PCR enzymem CleanSweep™ PCR Purification Reagent:

10 μl PCR produktu + 4 μl CleanSweep™ PCR Purification Reagent

Inkubace 10 minut při 37 °C, následná deaktivace enzymu při 80 °C

·        Přidání sekvenačních primerů do přečištěného produktu PCR:

5 μl roztoku primerů (5 μM) + 5 μl neředěného vzorku

·        Zaslání do laboratoří firmy Seqme s.r.o.

Sekvence sekvenačních primerů:

                                         Označení primeru

                                                                                                  Sekvence primeru

                                                                                                                           Délka produktu

                                              F15989

                                                                                                     1a

                                                         CCCAAAGCTAAGATTCTAAT

                                                                                                                               165 bp

                                              R16153*

                                                                                                     1b

                                                         CAGGTGGTCAAGTATTTATGG

                                              F16097*

                                                                                                     2a

                                                         TACATTACTGCCAGCCAC

                                                                                                                               137 bp

                                              R16233*

                                                                                                     2b

                                                         TGATAGTTGAAGGTTGATTGCTGT

                                             F16159 *

                                                                                                     3a

                                                         CATAAAAACCCAATCCACAT

                                                                                                                               146 bp

                                              R16304

                                                                                                     3b

                                                         ACTGTTAAGGGTGGGTAGGT

                                              F16247*

                                                                                                     4a

                                                         ACTCCAAAGCCACCCCTCA

                                                                                                                               164 bp

R16410

                                                     4b

                                                         GAGGATGGTGGTCAAGGGAC