1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif • Luděk Bláha, PřF MU •Testování ekotoxicity - BIOTESTY OPVK_MU_stred_2 figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •Ekotoxikologický biotest •"Experimentální (zpravidla laboratorní) metody stanovení toxického působení stresorů (toxických látek) na přírodní organismy" • • • •1) Standardní biotesty •2) Alternativní biotesty •3) Další biotesty (specifické mechanismy, in vitro testy) • •4) Testy procesů (biodegradabilita, bioakumulace ...) • •5) Testy orgánové toxicity s laboratorními zvířaty • obratlovci, savci "humánní toxikologie" • • •6) Experimentální mikro a mezokosmy • •7) Polní studie • •Laboratorní •ekotoxikologické •biotesty • •In situ •hodnocení efektů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EXPERIMENTÁLNÍ HODNOCENÍ EKOTOXICITY 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •STANDARDIZOVANÉ BIOTESTY • •Během času byly vypracovány metody, které jsou evidovány, doporučovány nebo realizovány v rámci: •- organizací evidujících standardy (ISO.org, ČSNI.cz, ASTM.org ...) •- dalších (mezi)národních organizací (OECD.org, WHO.int, Evropská Unie – ecb.jrc.it, US-EPA – EPA.gov, národní vlády a zákony ...) • •Existují standardizované postupy pro hodnocení jednodruhových, vícedruhových efektů i hodnocení polních experimentů a sledování 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif §Standardizace –maximální standardizace kroků experimentálního postupu s cílem omezit faktory "intra-laboratorní" variability –Detailní popis všech kroků (Standardní Operační Procedury – SOPs) • §Validace (validovaný postup, biotest) §validovaný biotest, tj. postup jehož výsledky byly srovnávány a ověřovány ve více laboratořích (okružní testy, srovnávací studie ...) §Prokázáno, že v různých laboratořích poskytuje srovnatelné výsledky § 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •STANDARDNÍ (standardizované) BIOTESTY § §Výhody standardních biotestů –zaručení jednotnosti a opakovatelnosti výsledků –validované výsledky (viz dále) jsou vhodné pro ROZHODOVÁNÍ (stanovení limitů pro prostředí, sanace, pokuty ...) –Lze pracovat přímo s využitím dostupné „Standardní procedury“ – §Celá řada nevýhod (viz také dále), zejména: –omezená vypovídací hodnota ("akutní letalita pro Daphnia"), vhodné jen pro zařazení (klasifikace) toxicity látek (více vs. méně toxické ...) –omezený počet standardizovaných postupů, zpravidla jednoduché (akutní) efekty – 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Jaké vlastnosti má mít „modelový“ organismus pro standardizovaný biotest ? • §snadná dostupnost (laboratorní kultury, komerční dostupnost ...) §snadné uchování a chov v laboratorních podmínkách do dostatečných množství pro experimenty (rychlý reprodukční cyklus) §Známá biologie druhu a genetika příslušné kultury y §jsou prostudovány relativní citlivosti druhu / kultury k různým třídám toxických látek §citlivost druhu by měla být dobrým reprezentantem příslušné skupiny organismů §Daphnia à korýši / bezobratlí §Zebřička à kaprovité ryby / obratlovci 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •STANDARDY : Globálně nejvýznamnější jsou OECD Guidelines •http://www.oecd.org 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •OECD Guidelines – sekce „2“ Effects on biotic systems (= Ekotoxikologické testy) (2013 - celkem 37 standardizovaných návodů v této sekci; další sekce např. humánní toxicita) • •Detaily k vybraným (nejčastěji užívaným) testům à viz dále 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •ALTERNATIVNÍ EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY §Alternativní ekotoxikologické biotesty –označení pro biotesty, které (doposud) nebyly zcela VALIDOVÁNY a akceptovány regulujícími organizacemi (vlády, zákony) –vypovídací hodnota však zpravidla koreluje se "standandardními" testy – –Vlastnosti alternativních testů: miniaturizace (šetření materiálem, vzorkem ...) dobrá dostupnost organismů bez nutnosti dlouhodobých kultivací • – uchování dormantních stadií (cysty ....) např. v lednici rychlost a jednoduchost • •Někdy označovány jako MIKROBIOTESTY –nejrozšířenější jsou tzv. TOXKITY (www. microbiotests.be) –využívány v řadě laboratoří světa, postupná validace –řada "méně tradičních organismů" – prvoci, vířníci ... 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Stanovení ekotoxicity • •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY -EXPERIMENTÁLNÍ DESIGN – - •(Na co vše je třeba myslet při experimentech ?) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Ekotoxikologické testování – EXPERIMENTÁLNÍ DESIGN •řada charakteristik shodná pro testy v AKVATICKÉM a TERESTRICKÉM prostředí • •Základní parametry, které charakterizují biotest, a které je nutno evidovat, zaznamenat a zohlednit ke každému bodu – viz dále • •Komplexnost biologického systému •Doba expozice •Uspořádání expozice •Expoziční scénář •Biologický systém – organismus, druh •Další specifika biologického systému •Hodnocený parametr, endpoint •Další abiotické faktory v experimentu •Ověření expozice (chemická analýza testované látky v průběhu testu) • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY •Komplexnost biologického systému §jednodruhové, vícedruhové testy, testy vyšších stupňů (mikrokosmy..) – •Délka expozice § §akutní – sub-chronická (sub-letální) – chronická §konkrétní délka závisí na generační době organismu (bakterie <<< pstruh), klasifikace není zcela jednotná. Dělení zpravidla na: § §akutní = 24, 48 až 96 hod, zpravidla hodnocení letality §chronické – dny, týdny až měsíce, hodnocení letality a neletálních efektů (růst, malformace …) – 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 •Srovnání výsledků akutní a chronické toxicity •Pro většinu „nespecificky“ působících látek platí: • chronické testy: EC50 cca 10x nižší než akutní • Příklad Cu: - hodnoty EC50 (akutní vs. chronické testy) pro různé druhy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY • •Uspořádání expozice - výměna testovaného vzorku • •akvatické testy •statické (bez výměny roztoků - možné změny koncentrací, kyslíku) •statické s obměnou média (výměna v definovaných časech, á 24 h) •recirkulační (recirkulace média, technicky náročnější ...) •průtočné (kontinuální udržování koncentrací, technicky náročné ...) • •testy toxicity sedimentů • •terestrické testy •zpravidla jednorázové dávkování = statické figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY •Expoziční scénáře (jakým způsobem je organismus vystaven látce?) § §Scénáře pro akvatické testy §obvykle expozice celých organismů (příjem povrchem těla, dýchacím aparátem, potravou) -méně často- méně relevantní: jednorázové injekce – spíše farmakologické studie (ryby, vstup a dávka nejsou ovlivněny prostředím) - -testy zahrnují všechny významné skupiny organismů podle trofických úrovní – viz také dále: příklady rostliny (producenti), živočichové (konzumenti), bakterie (destruenti, dekompozitoři) figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY •Expoziční scénáře § §Scénáře pro terestrické testy -půda, sedimenty – bakterie, bezobratlí – kontakt celým povrchem (testy přímého kontaktu - solid phase tests) -rostliny – kořeny - kontakt s pevným nebo kapalným médiem, expozice plynným polutantům ze vzduchu -terestričtí živočichové - specifické expoziční scénáře: -injekce ("klasická" toxikologie – obratlovci – laboratorní hlodavci, ptáci), i.p. / i.m. / i.v. / s.c. -potrava – dávkování v potravě, aplikace gaváží (trubice přímo do žaludku) -respirace – kontaminace vzduchu – uzavřené nádoby/cely, inhalace - -často lze reálně předpokládat několik expozičních cest současně à předmět výzkumu: složitější uspořádání experimentů • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY •Výběr biologického systému - organismu § §závisí na CÍLECH stanovení: §jasné definice cílů – §"ochrana hospodářsky významných druhů ryb", §"ochrana kvality půdy – aktivity půdních mikroorganismů", §„ochrana vody před toxickým odpadem" ... §organismus je reprezentantem dalších živých organismů § §PRAXE – testování látek: §Organismus, typ expozice atd. - předepsán příslušným zákonem / standardem / normou §Výzkum §Lze (samozřejmě) definovat podle záměru/hypotézy výzkumu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY •Další specifikace biologického testovacího systému § §výsledek stanovení toxicity a interpretaci ovlivňuje řada dalších biologických parametrů – viz diskuze v části „Toxické efekty“ § §geneticky podmíněná citlivost příslušné kultury / klonu / variety ... §velikost a stáří jedinců §pohlaví §vývojové stadium (vajíčka, embrya, larvy, dospělci ... §Fyziologický stav a další podmínky •– optimum (choroby, potrava – antioxidanty ...) § § 1 figure4 figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY •Hodnocený biologický parametr, endpoint § §biotesty akutní toxicity §živočichové - nejčastěji hodnoceným parametrem je letalita, dále imobilizace (Daphnia) §autotrofové – řasy: růst, dělení, množství chlorofylu (fluorescence); rostliny cévnaté – klíčení, růst §destruenti – bakterie: růst, metabolická aktivita ... § §biotesty chronické toxicity §živočichové – neletální parametry – růst, reprodukční schopnosti a úspěšnost (testy reprodukce), specifické efekty - teratogenita §autotrofové – cévnaté rostliny – klíčení, růst, tvorba gamet/semen, rozmnožování ... • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY •Významné abiotické faktory v experimentu •Je třeba je vždy evidovat a hlídat (!), předepsány ve standardech (např. obsah kyslíku v průběhu akvatického testu) §teplota §světlo, světelná perioda §obsah a přístup kyslíku ! §pH §tvrdost vody – vliv na biodostupnost kovů (akvatické experimenty) §složení půdy (obsah org. uhlíku – vliv na biodostupnost) § • 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY •Ověření expozice •Ověření, že nedochází ke „ztrátám“ v průběhu expozice a že je zajištěna stabilní koncentrace: • Ztráty: sorbce na plast testovacích nádob (organické látky) • sorbce na sklo (kovy) • degradace / fotodegradace / biodegradace • •Chemické analýzy testovaných látek (vždy požadováno ve standardních testech) • - start expozice vs. ukončení expozice • - nejrůznější analytické metodiky – v současnosti nejčastější chromatografie • - kapalinová (látky polární) / plynová (nepolární) • - koncovka: nejmodernější – hmotnostní spektrometrie • - analýzy kovů – atomová absorbční spektrometrie, ICP / MS a další • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif •Biotesty - příklady OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY •- PŘÍKLADY – PRODUCENTI - figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ • •Řasové testy toxicity • Expozice 72-96 hod, • Hodnocení růstu (počítání buněk, absorbance, fluorescence) • - standardní uspořádání -Erlenmayerovy lahve, třepání • - miniaturizace - mikrodestičky • •Řasy •Pseudokirchneriella subcapitata (=Selenastrum capricornutum) •Scenendesmus quadricauda •Chlorella vulgaris • •Sinice •Microcystis aeruginosa • •Ekotoxikologické biotesty - producenti figure4 Klíčové k zapamatování: vyznačeno zeleně 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif figure4 figure4 •Sinice (cyanoBAKTERIE) Microcystis aeruginosa http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/Pseudokirchneriella_alga_database.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 •TESTY EKOTOXICITY S ŘASAMI (pokračování) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • • •Řasové testy toxicity • •Alternativní mikrobiotest -miniaturizace -rychlá dostupnost živých řas (dlouhodobé uchování : alginátové kuličky) • • ALGALTOXKIT (TM) • • P. subcapitata (Selenastrum capricornutum) • •ALTERNATIVNÍ TESTY - řasy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Příklad – ekotoxicita cytostatik •(Zounková et al. 2010 Chemosphere 81:253-260) •5-Fluorouracil • • • •Cytarabin • • • • •Gemcitabin • • Metabolity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Inhibice růstu řas – cytostatika •(Zounková et al. 2010 Chemosphere 81:253-260) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ • •Akvatický testy toxicity s okřehkem (Lemna minor) • • - standardní uspořádání - 1 týden (7dní) - kádinky - vyhodnocení růstu (počty lístků) – srovnání s kontrolou • • •Ekotoxikologické biotesty - producenti figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •Test toxicity s terestrickými rostlinami • - nejjednodušší uspořádání (viz cvičení) - petriho misky s vlhčeným podkladem - přídavky testovaného vzorku (+kontroly) - expozice dny-týdny hodnocení : klíčení a růst rostlin - modifikace -realizace v hydroponických roztocích, v standardní půdě, testování přírodních vzorků půdy ... - •Zástupci •Dvouděložných ... Hořčice bílá, Bob setý, Salát •Jednoděložných... • Obilniny (ječmen) • •Ekotoxikologické biotesty - producenti 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxicita PAHs a jejich N-derivátů pro rostliny •(Pašková et al. 2006 Environmental Chemistry and Ecotoxicology 25:3238–3245) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxicita PAHs a jejich N-derivátů pro rostliny •(Pašková et al. 2006 Environmental Chemistry and Ecotoxicology 25:3238–3245) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxicita PAHs a jejich N-derivátů pro rostliny •(Pašková et al. 2006 Environmental Chemistry and Ecotoxicology 25:3238–3245) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Hodnocení GENOTOXICITY s využitím rostlin • -uspořádání - mikroskopické hodnocení chromozomových aberací v rychle rostoucích buňkách •(kořenová špička) - bob setý, cibule (Allium cepa) • - expozice kořenů do vodných roztoků (extraktů), nebo půdních vzorků •Ekotoxikologické biotesty - producenti 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY - PŘÍKLADY – - KONZUMENTI – BEZOBRATLÍ - figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Akvatické testy s bezobratlými jsou velmi běžné (nejčastější nejvíce dostupných dat - "Daphniové biotesty" • -uspořádání -kádinky, 10 zvířat v jedné variantě (3x replikát) -akutní testy – 24+48 h -vyhodnocení – pohyb (=mortalita) -reprodukční testy 21 dní •Akvatičtí planktonní korýši - nejčastější •Daphnia magna Ceriodaphnia dubia, Artemia salina (mořská) • •Další bezobratlí •bentičtí korýši – Gammarus, Hyallela azteca •hmyz – Pakomáři (Chironomus), jepice ... •Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif figure4 •Daphnia magna figure4 •Artemia salina •Ceriodaphnia dubia 1 •Gammarus figure4 •Chironomus riparius 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Zounkova, R., Z. Kliemesova, L. Nepejchalova, K. Hilscherova and L. Blaha (2011). "Complex Evaluation of Ecotoxicity and Genotoxicity of Antimicrobials Oxytetracycline and Flumequine Used in Aquaculture." Environmental Toxicology and Chemistry 30(5): 1184-1189. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Cytostatika – toxicita pro D. magna •(Zounková et al. 2010 Chemosphere 81:253-260) •Akutní toxicita – imobilizace •Reprodukční toxicita 5-FU •Fig. 1. Ecotoxicity (concentration–response curves) of the studied cytostatic drugs •and their metabolites. (A) Daphnia magna acute immobilization test. •Fig. 2. Effects of 5-fluorouracil (5-FU) on the reproduction of Daphnia magna (numbers of offsprings) in the 21-d chronic test. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ • •ALTERNATIVNÍ MIKROBIOTESTY ("toxkity") s bezobratlími •www.microbiotests.be • • •Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •TERESTRICKÉ PROSTŘEDÍ • •Půdní testy s bezobratlími • -uspořádání - umělá půda (písek, rašelina, jíl v definovaných poměrech), - přírodní půda (specifické vlastnosti – pH, obsah org. uhlíku) -jiné substráty (vlhčená petriho miska…) -akutní toxicita letalita – do 14 dní -reprodukce - 4-8 týdnů (podle organismu) •Organismy •Červi (kroužkovci – žížaly Eisenia fetida, háďátka, roupice) •Chvostoskoci (Collembola) – Folsomia candida • •Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Roupice Enchytreus crypticus https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRmkntbik1g5xcJHy4quv4R4q-_CbORVMF9y142qxoVJrR 6jZJ-qA Chvostoskok Folsomia candida Žížaly Eisenia fetida 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •Reprodukční toxicita – citlivější (cca 3x nižší IC50) • •Letalita pro dospělce •Příklad - stanovení toxicity Cu v půdě pro chvostoskoky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •PŮDA + SEDIMENTY • •Alternativní mikrobiotest TOXKIT (www.microbiotest.be) • • •Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •TERESTRICKÉ PROSTŘEDÍ • •Další biotesty s terestrickými bezobratlími • •VČELY - - testování insekticidů - dávkování v potravě - sledování mortality - •Moucha domácí - testování léčiv: Drosophila antiparazitika (hodnocení genotoxicity) - figure4 figure4 1 figure4 •Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY - PŘÍKLADY – - - KONZUMENTI – OBRATLOVCI – figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • -Velmi důležité (!) - nejčastější tři testy (řasy, dafnie, ryby) -Akvária, specifické požadavky pro každý druh -Akutní testy 96 h -Vyhodnocení - mortalita • -Prolongované a embryolarvální testy týdny až měsíce Dlouhodobé testy - letalita, růst, rozmnožování, - různá uspořádání (statické, průtočné ...) •Rybí druhy •Zebřička (Dánio pruhované - Danio rerio) •Živorodka duhová (paví očko) •V jiných státech: •Medaka japonská (Japonsko) •Jeleček velkohlavý (Pimephales promelas)- USA •Komerční druhy (pstruh duhový, kapr …) •Ekotoxikologické biotesty vodní – obratlovci: RYBY figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif figure4 •Živorodka duhová (Paví očko), Poecilia reticulata figure4 •Danio rerio (syn. Brachydanio rerio) figure4 •Karas (zlatá forma) 1 •Pimephales promelas figure4 •Pstruh 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Palíková, M., S. Navrátil, B. Maršálek and L. Bláha (2003). "Toxicity of crude extract of cyanobacteria for embryos and larvae of carp (Cyprinus carpio, L.)." Acta Vet. Brno 72: 437-443. • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Embryonální test s Danio rerio •Expozice - od vajíčka (1-3 h po oplodnění) do max 5 dní • (spotřebovává žloutek a nepřijímá externí potravu) • •Realizace (dle OECD) v 24-jamkových deskách • 20 vajíček individuálně v jamkách á 2 mL média • •Vyhodnocení – mortalita, pohyby, délka, morfologické změny • • •Testy s rybami – nahrazování dospělců: využití embryí •(embrya nejsou z hlediska zákona považována za „obratlovce“) ca 50b P0001 •Viz: výukové video a další materiály à IS.MUNI.CZ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ • •FETAX – Frog Embryo Teratogenicity Assay Xenopus • Drápatka (Xenopus laevis) - -Uspořádání - Petriho misky - Vajíčka až embryo 96 h expozice (dosažení stadia larvy bez žloutkového vaku) • • 1 1 1 1 •Ekotoxikologické biotesty - obratlovci 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Dvořáková, D., K. Dvořáková, L. Bláha, B. Maršálek and Z. Knotková (2002). "Effects of cyanobacterial biomass and purified microcystins on malformations in Xenopus laevis: teratogenesis assay (FETAX)." Environmental Toxicology 17(6): 547-555. • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Fig. 1. Mortality in the 96-h FETAX test after exposure to purified microcystin-LR (MLR) and the biomass of cyanobacterial •water blooms: •(A) Dose–response curves of purified MLR (scale in g/L on X axis), biomass containing natural microcystins (bloom dominated by Microcystis •aeruginosa), and biomass with no detectable microcystins (bloom dominated by M. wesenbergii; scale milligrams of •biomas d.w. per liter on X axis). Concentrations of purified MLR and the M. aeruginosa biomass are proportional (e.g., •12 mg of the biomass d.w. contained 10 g of MLR). •(B) Toxic effects of externally added MLR (25–250 g/L) to the cyanobacterial biomass with no natural microcystins. • •Asterisks •(**) indicate statistically significant difference from the effect of the biomass (300 g/L) with no MLR addition •(Pearson’s chi-square, p 0.01). Bars represent means standard error of the mean of two independent experiments •each performed in two parallels. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •TERESTRICKÉ PROSTŘEDÍ • •Ekotoxikologické testy s ptáky - -uspořádání - dietární testy toxicity, dávkování v potravě - krátkodobé (5 dní expozice + 3 dny) - reprodukční testy – dlouhodobé (týdny) • • •Hrabaví ptáci, křepelky • •Křepelka virginská (1) •(Northern bobwhite, Collinus virginianus) • •Křepelka japonská (2) (Japanese quail, Coturnis japonica) • •bažant, kur domácí, kachny ... figure4 figure4b 1 1 •Ekotoxikologické biotesty - obratlovci figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxikologické testy s laboratorními zvířaty Myš, Potkan, Křeček, Morče - -uspořádání - spíše humánní toxikologie, ale může být využito jako model pro přírodní hlodavce - dávkování – injekčně, inhalace, potrava - délka trvání: nejčastější akutní test – i.p. injekce 24 hod sledování - další testy – až 96 hod, dlouhodobé až 3 měsíce - kompletní testy karcinogenity 3 roky - řada specifických testů (embryotoxicita, teratogenita, imunotoxicita, kožní iritance ...) • • figure4b figure4c •Ekotoxikologické biotesty - obratlovci 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Experimentální design • •28 dní expozice v potravě 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Účinky microcystinu (toxin sinic) – skupiny 10 a 11 • à snížení hemoglobinu (A), zvýšená reakce na vakcinu (B) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY - PŘÍKLADY – - -MIKROBIÁLNÍ TESTY TOXICITY - 1c 1 1b • •MICROBIAL ZOO •DIRTLAND •WATERWORLD 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •(1) TEST AKUTNÍ TOXICITY - MICROTOX - mořská luminiscenční bakteri Vibrio fisheri - krátkodobá expozice testované látce (5-30 min) - sledování změn přirozené luminiscence – odpovídá toxicitě - - uspořádání: kyvety (zkumavky), stanovení v luminometru - • •Mikrobiální ekotoxikologické biotesty figure4 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •(2) Růstové testy toxicity s bakteriemi - - stanovení efektu toxické látky v médiu na růst bakterie - Pseudomonas putida, Escherichia coli ... - - expozice 16 hodin - kultivace bakterií (Erlenmayerovy nádoby, miniaturizace – mikrodestičky) - vyhodnocení – nárůst biomasy (zákal) - - • •Mikrobiální ekotoxikologické biotesty figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Zounkova, R., Z. Klimesova, L. Nepejchalova, K. Hilscherova and L. Blaha (2011). "Complex Evaluation of Ecotoxicity and Genotoxicity of Antimicrobials Oxytetracycline and Flumequine Used in Aquaculture." Environmental Toxicology and Chemistry 30(5): 1184-1189.0 •Flumequine •OTC 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •(3) Bakteriální testy GENOTOXICITY -často užívané biotesty hodnocení genotoxicity čistých látek i směsí - horší extrapolace pro člověka -> nemají metabolizační enzymy: bioaktivace (modifikace – externí přídavky S9 frakcí) - -3.1 Amesův test – (různé kmeny Salmonella typhimurium) - mutanti neschopní žít v minimálním mediu (chybějící enzym pro syntézu His) : genotoxin vyvolá reverzní mutace à bakterie přežívají - hodnocení – počítání kolonií revertantů na Petriho miskách - • •Mikrobiální ekotoxikologické biotesty 1b 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif (3) Bakteriální testy GENOTOXICITY - -3.2 Specifické testy - specifické transgenní bakterie s reporterovým genem pod kontrolou reparace DNA -Příklad gen pro beta-galaktosidázu - SOS chromotest - Poškození DNAà indukce aktivity: měření intenzity barvy •Mikrobiální ekotoxikologické biotesty http://www.ebpi-kits.com/images/Genotoxic%20Damage.png SOS Gene Response 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •(3) Bakteriální testy GENOTOXICITY - -3.2 Specifické testy - specifické transgenní bakterie s reporterovým genem pod kontrolou reparace DNA - Př. 1 gen pro luciferázu (recA test) - à mutace: měření luminescence •Mikrobiální ekotoxikologické biotesty 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Zounkova, R., Z. Klimesova, L. Nepejchalova, K. Hilscherova and L. Blaha (2011). "Complex Evaluation of Ecotoxicity and Genotoxicity of Antimicrobials Oxytetracycline and Flumequine Used in Aquaculture." Environmental Toxicology and Chemistry 30(5): 1184-1189.0 •Flumequine •OTC