Pavel Babica • (Eko)toxikologie: studium a predikce škodlivých účinků chemických látek na organismy Úč k šší h ú í h b l ké ( d l l č )• Účinky na vyšších úrovních biologické organizace (jedinec, populace, společenstvo) jsou zprostředkovány změnami na nižších úrovních (orgány, tkáně, buňky, makromolekuly) Adverse Outcome Pathway (Dráha škodlivého účinku) Chemical Macro- Molecular Interaction Cellular Response Organ Response Organism Response Population Response Tissue Effect Molecular Key Event 1 Key Event 2 Key Event 3 Adverse • Proteiny Molecular Initiating Event Key Event 1 Key Event 2 Key Event 3 Adverse Outcome • klíčové biomakromolekuly • jsou přímým cílem působení řady toxikantů (strukturní proteiny, receptory, enzymy) • jsou nepřímo ovlivněny působením toxikantů (poškození DNA -> změny aktivity proteinů, signálních a regulačních drah) • jakékoli změny (vč. Škodlivých účinků) v organismu (fenotypu) jsou dány/doprovázeny změnami v genové expresidány/doprovázeny změnami v genové expresi Proteiny • Vlastnosti – struktura, fyzikálně-chemické vlastnosti • Funkce• Funkce • Metody studia • Izolace, separace, denaturace, purifikace/frakcionace • Kvantifikace • Identifikace • Konkrétních zájmových proteinů (hypothesis based)• Konkrétních zájmových proteinů (hypothesis-based) • Sledování globálních změn v proteomu (exploratory approach: proteomika)  Finální produkt genové exprese Finální produkt genové exprese Proces přenosu genetické informaceProces přenosu genetické informace (www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf) 80 Voda 60 70 DNA 40 50 bsah RNA 20 30 40 %ob Proteiny Polysacharidy 0 10 20 Polysacharidy Fosfolipidy0 Celkem Suchá Hmotnost Ionty, malé molekulyHmotnost molekuly Alberts et al. (1998): Základy buněčné biologie  Katalýza – enzymy ◦ Metabolismus – energetický (RuBisCo, pepsin), detoxikace (cyt P450) ◦ Syntéza makromolekul – DNA polymeráza, reverzní transkriptáza ◦ Signálování a regulace – acetylcholinesteráza, proteinkináza C, HAT/HDAC …  Strukturní funkce – mechanická opora ◦ Extracelulární - kolagen, elastin; Intracelulární – tubulin, aktin; Mezibuněčné spoje – occludin …  Transport molekul ◦ Hemoglobin, lipoproteiny, iontové kanály a pumpy …  Pohyby ◦ Myosin (svaly), kinesin & mikrotubuly (pohyb organel v buňkách), dynein (bičíky, brvy)…  Zásobní funkce ◦ Feritin (játra), kasein, ovalbumin …j  Signální a regulační funkce ◦ Růstové faktory a hormony – endokrinní (insulin), parakrinní (EGF, cytokiny) … ◦ Transkripční faktory – obecné (TATA-binding proteins), „speciální“ – HSF, myc, CREB … ◦ Receptory – membránové (GPCR, RTK, AChR, rhodopsin), vnitrobuněčné (ER, AhR, PPAR, RXR/RAR) …  Imunita ◦ Likvidace patogenu: Komplement, Protilátky, Host-defense peptidy (defensiny, magainin) ◦ Rozpoznávání: MHC glykoproteiny  Další (hemokoagulace, luminiscence, toxiny …)  Proteiny = polypeptidy  Řetězce aminokyselin AminoskupinaKarboxylováskupina hlík Řetězce aminokyselin ◦ α-aminokyseliny ◦ L stereoisomery α-uhlík ◦ L-stereoisomery ◦ Amfionty ◦ 20 proteinogenních aminokyselin Postranní řetězec ◦ 20 proteinogenních aminokyselin  Peptidová vazba Karbon lo á + aminosk pina N-konec C-konec ◦ Karbonylová + aminoskupina ◦ N-konec / C-konec P t té Proteosyntéza ◦ Translace Rib ó dl RNA lá Peptidová vazba ◦ Ribozómy – dle RNA templátu http://en.wikipedia.org/wiki/File:AminoAcidball.svg N-konec C-konec Iniciace – iniciační kodon (AUG), N-koncová aminokyselina Elongace – prodlužování řetězce amino->karboxy směrem Terminace – terminační / stop kodon http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/organic/translation.html  soubor pravidel pro převod genetické informace v DNA (respektive RNA) na primární strukturu bílkovin - tj. pořadí aminokyselin v řetězci  64 -> 20(21) aminokyselin, 1x start kodon, 3x stop kodon 64 > 20(21) aminokyselin, 1x start kodon, 3x stop kodon Standardní genetický kód 1. báze 2. báze 3. báze U C A G UUU UCU UAU UGU U U UUU Phenylalanine (Phe/F) UCU Serine (Ser/S) UAU Tyrosine (Tyr/Y) UGU Cysteine (Cys/C) U UUC UCC UAC UGC C UUA UCA UAA STOP (Ochre) UGA STOP (Opal) A STOP T t h Neutral Nonpolar Leucine (Leu/L) UUG UCG UAG STOP (Amber) UGG Tryptophan (Trp/W) G C CUU CCU Proline (Pro/P) CAU Histidine (His/H) CGU Arginine (Arg/R) U CUC CCC CAC CGC C CUA CCA CAA Glutamine CGA A r Neutral Polar ( ) ( g )Glutamine (Gln/Q)CUG CCG CAG CGG G A AUU Isoleucine (Ile/I) ACU Threonine (Thr/T) AAU Asparagine (Asn/N) AGU Serine (Ser/S) U AUC ACC AAC AGC C AUA ACA AAA L i AGA A i i A l Basic (Thr/T) Lysine (Lys/K) Arginine (Arg/R)AUG[A] Methionine (Met/M) ACG AAG AGG G GUU Valine GCU Alanine GAU Aspartic acid (Asp/D) GGU Glycine U GUC GCC GAC GGC C Acidic http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_code G Valine (Val/V) Alanine (Ala/A) Glycine (Gly/G)GUA GCA GAA Glutamic acid (Glu/E) GGA A GUG GCG GAG GGG G c i k li Neutral, nonpolar Neutral, polar •α-aminokyseliny •L-stereoisomery •20 proteinogenních aminokyselin (+ Selenocystein)aminokyselin (+ Selenocystein) •Neutrální nepolární WFGAVILMP •Neutrální polárníYSTNQC •Kyselé DE•Kyselé DE •Zásadité KRH •Esenciální •Člověk: FVTWMLIKH (RCGQPY)•Člověk: FVTWMLIKH (RCGQPY) •Postranslační modifikace Basic A idi Basic Acidic http://www.mun.ca/biology/scarr/iGen3_06-02.html • Amfionty• Amfionty • NH3+ / COO• Isoelektrický bod: pH(I), pI, IEP h d H ři k é á l k l k l ý l ý áb j• hodnota pH při které má molekula v roztoku nulový volný náboj pH < pI … kladný náboj pH = pI … nulový náboj pH > pI záporný nábojpH > pI … záporný náboj Glycine Lysin l á k lLysin Glutamová kyselina pI=9.74 pI=3.22  Skládání proteinů (folding)  Štěpení (proteolýza)  Modifikace aminokyselinových zbytků Modifikace aminokyselinových zbytků  Glykosylace => glykoproteiny  Fosforylace => fosfoproteiny  Serin, Threonin, Tyrosin (O-, fosfoestery) Hi tidi (N f f idát) Histidin (N-, fosforamidát)  Lipidylace  N-Myristoylace, S-palmitoylace, S-prenylace (farnesyl, geranylgeranyl), GPI-kotva A l Acylace  Acetylace/Deacetylace (např. histony), formyl, propionyl-, malonyl-, sukcinyl-, butyryl-…  Alkylace – nejč. methylace  Oxidace, hydroxylace, sulfatace, Ƴ-karboxylace  S-nitrosylace  Adenylylace (Adenosinmonofosfát), Ubikvitinylace (Ubikvitin), Sumoylace (SUMO1), ADP-ribosylace, Sl hi lglutathionylace  Arginylace, polyglutamylace, polyglycinilace  Vazba prostetických skupin (lipoát, flavinová skupina, hem C…) ů Disulfidické můstky – Cystein => „Cystin“ PROTEOM – soubor proteinů exprimovaných genomem, organismem, tkání, buňkou v určitém okamžikug , g , , http://www.piercenet.com/method/overview-post-translational-modification#ptms Primární, sekundární, terciární, kvartérní http://sites.sinauer.com/animalphys3e/boxex02.01.html  Primární struktura= pořadí aminokyselin v řetězci • Dána pořadím nukleotidů v DNA/RNA • Unikátní pro daný protein • Definuje strukturu a funkci• Definuje strukturu a funkci • Kovalentní peptidová vazba • 20 proteinogenních aminokyselin (+ seCys) • Postranslační modifikace http://challieze.wordpress.com/tag/proteins-primary-sturcture-secondary-structure-tertiary-structure/  Primární struktura= pořadí aminokyselin v řetězci •Velikost proteinů •Od 10 až >10000 zbytků aminokyselin, typicky 50-2000 (<10 … peptidy) ( h l )•(Brocchieri & Karlin, 2005): •cca 34 000 lidských proteinů •medián 375 zbytků aminokyselin • Molekulová hmotnost 1-1000 kDa, typicky 10-200kDa, medián cca 50 kDa ekvencíPočets Počet aminokyselinových zbytků http://commons.wikimedia.org/wiki/File:AminoAcid_length_distribution_2010.svg http://www.mad-cow.org/00/annotation_frames/tools/genbrow/hgwdev.html •Isoelektrický bod  Primární struktura= pořadí aminokyselin v řetězci •Isoelektrický bod • Počet a podíl zbytků kyselých a bazických aminokyselin Kyselé: Asp (D) Glu (E)• Kyselé: Asp (D), Glu (E) • Zásadité: Lys (K), Arg (R), His (H) Vý PTM (f f l• Význam PTM (fosforylace -> pokles pI) • Kyselé proteiny – nízká hodnota pI negativní náboj při fyziologickémpI, negativní náboj při fyziologickém pH • Bazické proteiny – vysoká hodnota pI kladný náboj při fyziologickém • Online pI / MW kalkulátorypI, kladný náboj při fyziologickém pH p y •http://web.expasy.org/compute_pi/ •http://isoelectric.ovh.org/ •Zohlednění postranslačních modifikací: •http://proteomics.mcw.edu/promost.html http://www.mad-cow.org/00/annotation_frames/tools/genbrow/hgwdev.html • Primární struktura • Predikce ze sekvence DNA nebo mRNA • Edmanova degradace (automatizované sekvenátory) • Hmotnostní spektroskopie S k dá í iá í k• Sekundární, terciární struktura • Rentgenová strukturní analýza (X-ray crystallography) • Protein NMR• Protein NMR • Elektronová kryomikroskopie http://www.sbmp-itn.eu/sbmps/research_method/ http://www.masontechnology.ie  Sekundární struktura – lokální prostorové uspořádání • Vodíkové můstky• Vodíkové můstky • Základní modely skládání : α šroubovice ß skládaný list (3.613 helix ) • 310 helix, Π helix, random coil… Supersekundární struktury / motivy: Beta vlásenka, Řecký klíč, Omega smyčka, Helix-smyčka-helix, Zn http://en.wikipedia.org/wiki/Alpha_helix http://en.wikipedia.org/wiki/Beta_sheet smyčka, Helix smyčka helix, Zn prsty, Helix-obrátka-helix…  Terciární struktura – celkové prostorové uspořádání řetězce • Vodíkové můstky , Hydrofobní interakce (van der Waals), Iontové íl Di lfid é ů ksíly, Disulfidové můstky http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Proteins9.html http://challieze.wordpress.com/tag/proteins-primary-sturcture-secondary-structure-tertiary-structure/  Kvartérní struktura – podjednotkové uspořádání • Seskupení tvořené několika polypeptidovými řetězci / proteiny l b l http://bio1151b.nicerweb.com/Locked/media/ch05/hemoglobin.html http://homepage.eircom.net/~philipoconnell/Thesis%20PhD%20intro.htm Imunoglobuliny • (Eko)toxikologie: studium a predikce škodlivých účinků chemických látek na organismy Úč k šší h ú í h b l ké ( d l l č )• Účinky na vyšších úrovních biologické organizace (jedinec, populace, společenstvo) jsou zprostředkovány změnami na nižších úrovních (orgány, tkáně, buňky, makromolekuly) Adverse Outcome Pathway (Dráha škodlivého účinku) Chemical Macro- Molecular Interaction Cellular Response Organ Response Organism Response Population Response Tissue Effect Molecular Key Event 1 Key Event 2 Key Event 3 Adverse • „Moderní metody (studia proteinů) v ekotoxikologii d í l ží é č “ Molecular Initiating Event Key Event 1 Key Event 2 Key Event 3 Adverse Outcome • Moderní - ve smyslu „používané v současnosti“ • Moderní - ve smyslu snahy studovat a charakterizovat mechanismy vedoucí ke škodlivým účinkům chemických látek => porozumění mechanismům => lepší předpověď účinků na vyšších úrovních=> porozumění mechanismům => lepší předpověď účinků na vyšších úrovních biologické organizace => rychlejší, efektivnější, levnější a eticky méně kontroverzní metody pro hodnocení (eko)toxicity chemických látek (proteinové biomarkery) => identifikace nových biomarkerů a klíčových událostí vedoucích k toxicitě => cílený vývoj, optimalizace a validace alternativních testů toxicity • Organismy = jsou z významné části tvořeny proteiny • Téměř jakýkoli škodlivý účinek nějakým způsobem ovlivní proteiny/proteom • Příklady možných změn v proteomu působením toxických látek: • Přímé poškození (např. oxidační) • „Globální“ inhibice proteosyntézy • Ovlivnění enzymatické aktivity (metabolické signální enzymy)• Ovlivnění enzymatické aktivity (metabolické, signální enzymy) • Aktivace receptorů a signálních drah • Změny v postranslačních modifikací proteinů (fosforylace aj.) ů• Ovlivnění lokalizace proteinů • Změny v genové expresi • Aktivace/inaktivace funkce proteinu v důsledku mutací Metody studia proteinů v ekotoxikologii velká rozmanitost přístupů technik metod a jejich kombinací- velká rozmanitost přístupů, technik, metod a jejich kombinací - existence alternativních / paralelních řešení  Extrakce a izolace proteinů - Homogenizace vzorku a lyze buněk - Rozpuštění a extrakce proteinů F k i b l lá í h l ž k Frakcionace subcelulárních složek ◦ rozpustnost, velikost, vznášivost  Denaturace  Stanovení výtěžku / koncentrace proteinů ◦ Biuret, Lowry, BCA, Bradford, UV spektroskopie  Přečištění a obohacení zájmové skupiny proteinů ◦ precipitace, ultrafiltrace, dialýza, chromatografie (gelová, afinitní) ◦ Fosforproteiny, glykoproteiny, ubikvitinylované proteiny, imunoprecipitace  Separace proteinů podle náboje, MW, pI ◦ Elektroforéza, Isoelektrická fokusace  Detekce / kvantifikace ◦ Hodnocení enzymatické aktivity proteinuHodnocení enzymatické aktivity proteinu ◦ Detekce pomocí specifických protilátek  V roztoku (EIA, RIA, ELISA)  Na membráně (dot-blot) Na membráně po SDS PAGE (Western blot) Na membráně po SDS-PAGE (Western blot)  „In situ“ -> imunocytochemie / imunohistochemie ◦ MS-identifikace  štěpení proteázami na peptidy  Obohacení zájmové frakce peptidů (např fosfopeptidy)  Přečištění (odsolení)  LC-MS/MS Hypothesis Exploratory http://piercenet.com Mechanická homogenizace  mletí drcení krájení mletí, drcení, krájení  třepání v přítomnosti abrazivních materiálů (sklěnené, ZrO2, ZrSiO4, o l é k l čk )celové kuličky) Ultrazvukové homogenizátory  Enzymaticky – lyzozym  Chemicky – použití detergentů  Probíhá zpravidla v přítomnosti extrakčního činidla (lyzačního pufru)  Musí být kompatibilní s navazujícím krokem  Často chlazení  Ledová tříšť (0-4C), Chladící/mrazící stojánky (4 … -80C)  Rychlé zmrazení: Chladící lázně o definované teplotě (např. suchý led & aceton 78C) kapalný dusík ( 196C)aceton –78C), kapalný dusík (-196C)  Skladování: lednice, -20C, -80C, -196C  Minimalizace rozmražování/zamražování (alikvoty!)  Lyzační/extrakční pufr Lyzační/extrakční pufr ◦ Lyze buněk ◦ Rozpuštění proteinůRozpuštění proteinů  Celý proteom nebo jen vybrané kompartmenty (membrána, jádro, cytoskelet…) či frakce (např. fosfoproteiny)? ů• Zachování nativní konformace / aktivity proteinů nebo denaturace? ◦ Omezení nežádoucích změn vzorku  Stabilizace molekul, prevence oxidativního poškození  Inhibice proteolýzy, defosforylace Inhibice růstu bakterií Inhibice růstu bakterií •Aminokyselinové složení •Nepolární vs. Polární aminokyseliny •pH •Amfolyty •nízká rozpustnost v oblasti pH=pI •minimalizace celkového náboje a odpudivých elektrostatických sil bránících agregaci a precipitaci proteinů Salinita •Malé množství neutrálních solí => nárůst ionizace funkčních skupin (tzv. vsolení, salting-in) vede k vytvoření ochranného pláště iontů soli kolem proteinu a jeho stabilizaci v roztoku • Zvyšování koncentrace anorganických solí => ionty solí odebírají proteinům jejich hydratační obal, což vede k http://www.siumed.edu/~bbartholomew/course_material/protein_methods.htm http://cacingkecil.wordpress.com/sitemap.xml hydratační obal, což vede k postupnému vysolení (vysrážení, salting-out) proteinu z roztoku. Buffer pH range Citric acid - NaOH 2.2 - 6.5Citric acid NaOH 2.2 6.5 Sodium citrate - citric acid 3.0 - 6.2 Sodium acetate - acetic acid 3.6 - 5.6 Cacodylic acid sodium salt - HCl 5.0 - 7.4 MES - NaOH 5.6 - 6.8 Sodium dihydrogen phosphate - disodium hydrogen phosphate 5.8 - 8.0 I id l HCl 6 2 7 8Imidazole - HCl 6.2 - 7.8 MOPS - KOH 6.6 - 7.8 Triethanolamine hydrochloride - NaOH 6.8 - 8.8 Tris HCl 7 0 9 0Tris - HCl 7.0 - 9.0 HEPES - NaOH 7.2 - 8.2 Tricine - NaOH 7.6 - 8.6 Sodium tetraborate - boric acid 7 6 - 9 2Sodium tetraborate boric acid 7.6 9.2 Bicine - NaOH 7.7 - 8.9 Glycine - NaOH 8.6 - 10.6 (zpravidla v koncentraci 20-50 mM)  NaCl, KCl, (NH4)2SO4  50-150 mM 50 150 mM  zachování iontové síly http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_purification/extraction_clarifica tion/lysis_buffer_additives/  Surfaktanty nebo jejich směsi L b ěk l bili (hůř ý h) i ů Lyze buněk, solubilizace (hůře rozpustných) proteinů Neiontové: Tween20 Triton X-100 Nonidet P40 Aniontové:Aniontové: Sodium dodecylsulfát (SDS) Sodium deoxycholát CTAB Zwitteriontové: CHAPS CHAPSOCHAPSO C7BzO ASB-14 Silné detergenty mohou způsobovat denaturaci proteinů!  Glycerol  5-10% bili i ů ( i í k f ) iž j b d stabilizace proteinů (nativní konformace), snižuje bod mrazu  Glukóza / Sukróza  25 mM  stabilizace lysozomálních membrán, potlačení uvolňování proteáz stabilizace lysozomálních membrán, potlačení uvolňování proteáz  Chelatační činidla – EDTA, EGTA  1-5 mM  Potlačení oxidačního poškození, metaloproteáz é k ( ) Dvojmocné kationty (Mg2+)  1-10 mM  Ligandy (ATP, GTP)  Redukční činidla Redukční činidla  Dithiothreitol (1-100 mM), 2-merkaptoethanol (0,05%)  Prevence oxidativního poškození, redukce disulfidických můstků  Chaotropní reagenty  Močovina (6-8M), thiomočovina (2M), guanidinium hydrochlorid (6M)  Denaturace proteinů, vhodné pro aplikace nekompatibilní s detergenty  Antibakteriální látky  Azid sodný (0 02-0 05%) Azid sodný (0,02 0,05%)  Roztoky nativních proteinů dlouhodobě uchovávané v chladu http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_purification/extraction_clarifica tion/lysis_buffer_additives/ Protease inhibitor Concentration Solvent Inhibice  Inhibitory proteáz Protease inhibitor Concentration Solvent Inhibice Aprotinin 1-2 µg/ml water serine proteases Benzamidine 15 µg/ml water serine proteases EDTA EGTA 1 10 mM water metallo proteasesEDTA, EGTA 1-10 mM water metallo proteases Leupeptin 1-2 µg/ml water cysteine and serine proteases PMSF 0 1 1 0 mM isopropanol serine proteasesPMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 0.1-1.0 mM isopropanol serine proteases Pepstatin A 1µg/ml methanol aspartic proteases Ph h t C t ti S l t I hibit Antipain, bestatin, AEBSF, E-64…  Inhibitory fosfatáz Phosphatase Inhibitor Concentration Solvent Inhibiton Na3VO4 1 mM water Tyr phosphatases NaF 5 10 mM water Ser/ThrNaF 5-10 mM water Ser/Thr phosphatases http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_purification/extraction_clarifica tion/lysis_buffer_additives/  Zachování nativní struktury a aktivity proteinu  Optimální pH, iontová síla, teplota  Nízké koncentrace detergentů:g  Neiontové 0,1-2%, iontové 0,01-0,5%  Nízké koncentrace redukčních činidel  1-10 mM DTT nebo 0,05% 2-merkaptoethanol 1 10 mM DTT nebo 0,05% 2 merkaptoethanol  Stabilizující látky (glycerol, dvojmocné kationty, chelatační činidla)  !!! Inhibitory proteáz, případně fosfatáz Nonidet-P40 (NP40) buffer 50 mM Tris, pH 8.0  Příklady lyzačních pufrů (Abcam.com) Tris-HCl buffer (Cytosolové proteiny) RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 (nebo Triton X-100) Tris-Triton buffer (Cytoskeletární proteiny) •20 mM Tris-HCl, pH 7.5 RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay buffer) 50 mM Tris, pH 8.0 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 10 mM Tris, pH 7.4 100 mM NaCl 1 mM EDTA, 1 mM EGTA 1% Triton X-100 1.0% NP 40 0.5% sodium deoxycholate 0.1% SDS 0.1% SDS 0.5% sodium deoxycholate 10% glycerol  Narušení nekovalentních vazeb a interakcí udržujících přirozenou (nativní) konformaci proteinu  Narušení S-S vazeb => Ztráta kvartérní / terciární / sekundární struktury => Zachována pouze primární struktura (rozvinutý, volně ohebný polypeptidový řetězec)  Vysoká teplota – H-můstky, hydrofóbní interakce  Organická rozpouštědla (methanol, ethanol) -H-můstky á íl ( l á í) Iontová síla (vysolování)  pH (TCA, HAC) – iontové interakce  Iontové detergenty (2-4% v/v) ů Redukční činidla (dithiothreitol DTT, dithioerythritol DTE, 2-merkaptoethanol) – S-S můstky  Chaotropní reagenty (močovina, thiomočovina, guanidinium hydrochlorid) -H-můstky  Cross-linkery (paraformaldehyd, glutaraldehyd) Vyžaduje-li navazující metoda studia proteinů denaturaci, je možné ji provést již v extrakčním kroku Příklady denaturujících redukujících lyzačních pufrůPříklady denaturujících redukujících lyzačních pufrů  4% SDS, 100 mM Tris pH 7.6, 100 mM DTT (Wisniewski et al 2009, Nat Met)  8M močovina, 50 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA  8M močovina, 40 mM Tris, pH 8, 4%CHAPS, 65 mM DTT …  Kompatibilita jednotlivých metod:  SDS+DTT+vysoká teplota: OK x Močovina+vysoká teplota: => karbamylace proteinů  Kompatibilita s navazujícími kroky Kompatibilita s navazujícími kroky  Aniotové detergenty interferují při isoelektrické fokusaci (zwitteriontové jsou OK)  Vysoké koncentrace silných detergentů interferují s trypsinovým štěpením Volbou lyzačního pufru lze přednostně izolovat frakce proteinů s rozdílnou rozpustností Lokalizace Doporučený pufr Celá buňka NP-40, RIPA Cytosol (rozpustné) Tris-HClCytosol (rozpustné) Tris HCl Cytoskelet Tris-Triton Membránové NP-40, RIPA Jaderné RIPAJaderné RIPA Mitochondriální RIPA http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11379 Sekvenční extrakcí řadou lyzačních pufrů lze izolovat i několik různých proteinových frakcí => komerčně dostupné kity různých výrobců => různé subcelulární frakce a jejich kombinace  Příklad – izolace frakce rozpustných cytosolových a frakce membránových proteinů (Sigma PROTTWO): Rozpustné proteiny solubilizovány v 5mM Tris pufru Nerozpustné proteiny (membrána, cytoskelet) odděleny centrifugací (14000xG) a následně solubilizovány pufrem chaotropních reagentů a detergentu (močovina, thiomočovina, C7BzO)  Příklad – Subcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cells (Pierce 78840) CEB Cytoplazmový extrakční pufr => cytosolové proteiny MEB Membránový extrační pufr => membránové proteinyMEB Membránový extrační pufr => membránové proteiny NEB Jaderný extrakční pufr => jaderné proteiny MNase Mikrokokální nukleáza => chromatin-vázané proteiny PEB P ellet extrakční pufr => cytoskeletPEB P ellet extrakční pufr > cytoskelet http://www.piercenet.com/product/subcellular-protein-fractionation-kit-cells  Příklad – Subcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cells (Pierce 78840) Snížení komplexity vzorku Obohacení zájmové frakce proteinů Lokalizace proteinů Translokace proteinů •Differential centrifugation •Dělení buněčných složek podle hustoty a velikosti P é š á í áč k / RCF j d li é k k•Postupné zvyšování otáček / RCF pro jednotlivé kroky Homogenát ( š é Mitochondrie Ribosomy(neporušené organely) Celé buňky, jádra, Lyzosomy Peroxisomy Mikrosomy Ribosomy, Viry Velké makromolekuly cytoskelet ymakromolekuly http://en.wikipedia.org/wiki/Differential_centrifugation http://upendrats.blogspot.cz/2012/12/the-basic-separation-technique.html •Rate Zonal Density Gradient CentrifugationCentrifugation •Dělení buněčných složek podle jejich rychlosti sedimentace (jejich velikosti) v mírném gradientuvelikosti) v mírném gradientu sacharózy (5-20%) •(Equilibrium) Density Gradient Centrifugation •Dělení buněčných složek podle vznášivosti (hustoty) ve strmém gradientu sacharózy (20-70%) nebo CsCl http://www.expertsmind.com/topic/cellular-fractionation/equilibrium-density-gradient-centrifugation-92091.aspx http://upendrats.blogspot.cz/2012/12/the-basic-separation-technique.html  Posouzení výtěžnosti extrakce, frakcionace, purifikace  Standardizace navazujících kroků – použití definovaného a pro různé vzorky ekvivalentního množství proteinů (např. pro gelovou elektroforézu, štěpení trypsinem…)  Enzymatické aktivity koncentrace metabolitů ve tkáních => Enzymatické aktivity, koncentrace metabolitů ve tkáních > zpravidla se vztahují na množství proteinů  Kvantifikace a charakterizace mikroorganismů a jejich společenstev UV spektrofotometrie ◦ Absorbance zbytků aromatických aminokyselin tyrosinu, tryptofanu a f l l ř 280fenylalaninu při 280 nm ◦ Jednoduchá, rychlá metoda, malé objemy vzorku (Nanodrop etc.) ◦ Závislá na aminokyselinovém složení◦ Závislá na aminokyselinovém složení proteinu ◦ Lze měřit i při kratších vlnových délkách – vyšší citlivost, ale vyšší pravděpodobnost f í ( f )interferencí (pufr) http://www.biotek.com/resources/articles/peptides-amino-acids-fluorescence.html  Biuretová reakce ◦ Činidlo obsahující CuSO4, vínan sodno-draselný a N OHNaOH ◦ v alkalickém prostředí dochází k reakci peptidových vazeb s Cu(II) za vzniku modrofialového zbarvení ◦ Měří se absorbance při 540 nm  Lowryho reakce ◦ Měří se absorbance při 540 nm ◦ Nezávisí na aminokyselinovém složení, ale málo citlivá  Lowryho reakce ◦ Lowry et al. (1951) PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT. JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 193(1):265-275 =>14.10.2014: 305202 citací (1. na WOS) ◦ Dvoustupňová: Kombinuje biuretovou reakci s následným použitím Folinova činidla, kterép j ý p , se redukuje v přítomnosti komplexů Cu1+ a zbytků aromatických aminokyselin (W, Y) ◦ 10-1000 ug/mL, měření absorbance při 750 nm ◦ Existují modifikace (např. DC Bio-rad) http://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html  BCA reakce ◦ Peptidová vazba reaguje s ionty Cu2+ (CuSO4), které redukuje; následně sodná sůl kyseliny bicinchoninové (BCA) reaguje s ionty Cu(1+) za vzniku barevného komplexubicinchoninové (BCA) reaguje s ionty Cu(1+) za vzniku barevného komplexu ◦ 10-1000 ug/mL, absorbance se při 562 nm  Reakce Bradfordové Reakce Bradfordové ◦ barvení rozpuštěných proteinů roztokem Coomassie Brilliant Blue G-250 ◦ Nárůst absorbance při 595 nm◦ Nárůst absorbance při 595 nm ◦ Lineární pro koncentrace proteinů 20- 2000 ug/mL http://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html http://piercenet.com  Některé běžné složky lyzačních / extrakčních pufrů nejsou kompatibilní s kolorimetrickými metodami stanovení proteinů => vždy ověřit v tabulce komptibility pro příslušnou metodu, pufr a ředění vzorkup y p p , p  V ideálním případě mít stejné složení a ředění pufru jak pro vzorek, tak pro externí standard  Nutná externí kalibrace ◦ Bovinní sérový albumin (BSA) ◦ Ovalbumin (OVA)  V závislosti na složení aminokyselin h í ěk é šší dmohou mít některé proteiny vyšší odezvu než jiné DC Bio-Rad (Lowry Based) Assay absorption mechanism detection limit advantages disadvantages incompatible UV absorption 280 nm tyrosine and tryptophan absorption 0.1-100 ug/ml small sample volume, rapid, low cost with detergents and denaturating agents, high variabilityvariability Bicinchoninic acid 562 nm copper reduction (Cu2+ to Cu1+), BCA reaction with C 1+ 20-2000 ug/ml compatible with detergents and denaturating agents, low i bilit low or no compatibility with reducing agents Cu1+ variability age ts Bradford or Coomassie brilliant blue 470 nm complex formation between Coomassie 20-2000 ug/ml compatible with reducing agents, urea rapid incompatible with detergents brilliant blue brilliant blue dye and proteins urea, rapid g copper reduction by proteins Folin incompatible with detergents Lowry 750 nm proteins, Folin- Ciocalteu reduction by the copper-protein complex 10-1000 ug/ml high sensitivity and precision with detergents and reducing agents, long procedure Modified Lowry (DC Biorad) 750 nm copper reduction by proteins, Folin- Ciocalteu reduction by the 10-1500 ug/ml high sensitivity and precision, compatible with some d Limited compatiibility with reducing reduction by the copper-protein complex detergents, rapid agents http://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html  Zakoncentrování proteinů  Odstranění nežádoucích složek lyzačního pufruy p (detergenty, soli…) anebo odstranění proteinů  Organická rozpouštědla, kyseliny, soli  Příklad: Chloroform/Methanol precipitace:  Do Epp. Zkumavky napipetovat 100 uLroztoku proteinů  Přidat 400 uL methanolu, vortex, krátce stočit  Přidat 100 uL chloroformu, vortex, krátce stočit  Přidat 300 uL vody, vortex, stočit min. 13000 rpm (5 min) => proteiny budou na rozhraní dvou vrstev kapalin.kapalin.  Opatrně odebrat horní kapalnou vrstvu  Přidat 300 uL methanolu, vortex, stočit min 13000 rpm (5 min) => proteiny peletují na dno zkumavky  Odebrat supernatant, proteiny nechat uschnout na vzduchu  Rozpustit v požadovaném objemu a typu pufru  Další metody:  Trichlorooctová kyselina (TCA), TCA-aceton, TCADOC, sulfát amonný http://www.intechopen.com: Applications-of-calorimetry-in- a-wide-context-differential-scanning-calorimetry- isothermal-titration-calorimetry-and-microcalorimetry/  Filtry z membrán s malou velikostí pórů  Průchod vzorku docílen centrifugací Možný opakovaný proplach vzorku g  Komerčně dostupné patrony různých objemů a s různou propustností filtrů >3, >10, >30, >50, >100 kDa Tzv. MWCO = molecular weight cut-off  Semipermeabilní membrána umožňující průchod malýchp j p ý molekul -> osmóza  Klasicky „dialyzační střívko“, inzerty pro centrifugační zkumavky a mikrozkumavky, dialyzační rámečky, láhve, 96 mikrodeskymikrodesky  Objemy od 20 uL az po 250 mL, MWCO 2, 3.5, 7, 10, 20K https://www.emdmillipore.com http://oregonstate.edu/instruct/bb450/fall14/lecture/proteincharacterizationoutline.html http://piercenet.com  Gelová filtrace, size-exclusion chromatography  Vzorek je unášen mobilní fází procházející kolonou naplněnou porézní stacionární fází (pohyb mobilní fáze: gravitace nebo centrifugace)stacionární fází (pohyb mobilní fáze: gravitace nebo centrifugace)  Stacionární fáze umožňuje vstup malých molekul do pórů => zvyšuje jejich retenci  Velké molekuly nevstupují do pórů > migrují rychleji kratší retenční čas Velké molekuly nevstupují do pórů => migrují rychleji, kratší retenční čas  Komerčně dostupné kolony různých velikostí (uL až mL vzorku), různých formátů (kolonky, 96j destičky) s různými typy stacionární fáze s různým MWCO: ◦ Zeba Resin (MWCO 7K, 40K) ◦ Polyakrylamid Resin (MWCO 1.8K, 6K) ◦ Dextran Resin (MWCO 5K)Dextran Resin (MWCO 5K) ◦ Sephadex (dextran, MWCO 0,7-600 kDa) http://en.wikipedia.org/wiki/Size-exclusion_chromatography  Zrnka stacionární fáze mají navázanou molekulu / jsou tvořena molekulami interagujícími s cílovými proteiny => specifická vazebná aktivita  Protilátka rozpoznávající daný protein nebo antigen (Immunoafinitní chromatografie) k é í ( ) Konkrétní protein(y)  Soubor proteinů – protilátky proti ubikvitinu  Antigen rozpoznávaný protilátkou – purifikace protilátek  Substrát enzymu  IMAC (Immobilized Metal Ion chromatography), TiO2, Pro-Q Diamond – izolace fosfoproteinů Concavalin A / Wheat Germ Agglutinin (WGA) izolace Concavalin A / Wheat Germ Agglutinin (WGA) – izolace glykoproteinů  Purifikace značených rekombinantních/fúzních proteinů (GST, 6xHis, MBP, FLAG, )(GST, 6xHis, MBP, FLAG, …)  Komerčně dostupné kity  Možnost zakoncentrovat i proteinové komplexy -> studium interakcí proteinů http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/AffinityChrom.html o ost a o ce t o at p ote o é o p e y stud u te a c p ote ů  Lze realizovat v kolonkové podobě nebo v suspenzi („batch techniques“)  Zrnka sefarózy v roztoku/suspenzi s protilátkou a cílovým proteinem  Navázání protilátky na sefarózua á á p ot át y a se a ó u pomocí Protein A nebo Protein G  Imunoprecipitát oddělen centrifugací  Analýza imuno(ko)precipitátu Analýza imuno(ko)precipitátu http://piercenet.com  Pohyb nabitých molekul v elektrickém poli  Typicky v polyakrylamidovém gelu  Polyacrylamide Gel Electrophoresisv elektrickém poli  Polyacrylamide Gel Electrophoresis = PAGE ODA ODA Akrylamid (monomer) N,N'-Methylenebisacrylamide (cross linking monomer) +ANO -KATO Peroxodisíran amonný (Ammonium persulfate) – zdroj radikálů Tetramethylethylenediamine (TEMED) - katalyzátor y ( )(cross-linking monomer)  Různá uspořádání a varianty  Elektroforéza gelová, free-flow, kapilární I l k i ká f k http://www.bio-rad.com/en-ch/applications-technologies/polyacrylamide-gels http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Electrophoresis.gif  Isoelektrická fokusace  Isotachoforéza… % bis/akrylamidu – ovlivňuje velikost pórů a rigiditu gelurigiditu gelu  Velikost separovaných proteinů  Jednoduché gely - konstantní  Gradientové gely – nárůst koncetrace akrylamidu směrem k anoděakrylamidu směrem k anodě •Vertikální uspořádání PAGEVertikální uspořádání PAGE •Gel •v kazetě (mezi skly / plastovými destičkami) •Různé rozměry (mini cca 8 x 6 cm, standard cca 13 x 8 cm, velké >20 x 20 cm) lé é l b t ři b•nalévané v laboratoři nebo komerčně dostupné pre-cast gely • Vzorek do jamek (10-50 ug proteinů) •Umístění v tanku•Umístění v tanku •Rezervoár katodového a anodového pufru (upper / lower chamber) http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html http://www.siumed.edu/~bbartholomew/course_material/protein_methods.htm ( pp / ) • Zdroj napětí •Nativní PAGE •Nedenaturované neredukované proteiny •Rychlost migrace závisí na •Nábojij •Velikosti a tvaru molekuly /Hustota náboje/ Malé s vysokým neg. nábojem > >Malé s nízkým neg. nábojem ~ ~ velké s neg. vysokým nábojem > > Velké s neg. nízkým nábojem Typicky Tris-Glycinový elektrodový pufr & Tris-HCl PAGE gel  Separace proteinů v nativním stavu Odlišení proteinů se stejnou molekulovou hmotností X neumožňuje určit molekulovou hmotnostneumožňuje určit molekulovou hmotnost SDS-PAGE • Laemmli (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of b t i h T4 N t 227(5259) 680 5bacteriophage T4. Nature 227(5259):680-5 • 14.10.2014: přes 200 000 citací, 2. nejcitovanější článek na WOS  Denaturované a redukované proteiny Denaturace proteinů ve vzorku: SDS & mercaptoethanol (nebo DTT) & zahřátí p y  Uniformní náboj (SDS), rychlost migrace závisí na molekulové hmotnosti  Umožňuje určit molekulovou hmotnost: • Nanášecí pufr (2X): Molecular weight marker = žebříček standardů proteinů o známé MW p ( ) 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0.004% bromphenol blue and 0.125 M Tris HCl, pH 6.8 => smíchání se vzorkem v poměru 1:1 a zahřátí (55-100C) El k f i ký f 25 M T i 192 M• Elektroforetický pufr: 25 mM Tris-192 mM Glycine, 0.1%SDS pH 8.3-8.8 • Diskontinuální Tris-HCl PAGE gel: •Zakoncentrování vzorku do úzké zóny na vstupu do•Zakoncentrování vzorku do úzké zóny na vstupu do separačního gelu •4% zaostřovací gel, 125 mM Tris-HCl-0.1%SDS, pH 6.8 •separační gel, 375 mM Tris-HCl, pH 8.8 (4 …20%)p g , , p ( ) • tloušťka 0,5-1,5 mm • 100-200V => všechny proteiny budou mít záporný náboj Odhad molekulové hmotnosti pomocí SDS-PAGE •Komerčně dostupné směsi standardů od různých výrobců •Nebarvené markery – nejpřesnější nutno ale vizualizovat barvením (PonceauNebarvené markery nejpřesnější, nutno ale vizualizovat barvením (Ponceau S, Cooomassie etc.) •„Prestained“ – s navázaným barvivem, lze sledovat průběh migrace gelem během elektroforézy, ale odhad MW není tak přesný (barvivo ovlivňuje migraci)y, p ý ( j g ) Vliv koncentrace akrylamidu v gelu na rozlišení molekulovýchgelu na rozlišení molekulových hmotností šší k k l d l šíVyšší koncentrace akrylamidu – lepší rozlišení menších molekul a opačně http://piercenet.com http://abcam.com Efekt zaostřovacího gelu v diskontinuálním systému L li SDS PAGELaemmli SDS-PAGE GlyKatodový pufr: 25 mM Tris-192 mM Glycine, 0.1%SDS pH 8.3-8.8 4%S ki l Cl- 4%Stacking gel: 125 mM Tris-HCl, 0.1%SDS pH 6.8 >4% Running gel: 375 mM Tris-HCl, 0.1%SDS pH 8.8 Anodový pufr: 25 mM Tris-192 mM Glycine, 0.1%SDS pH 8.3-8.8ý p y p https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/multiphasic-buffer-systems Vizualizace proteinů v gelu •Coomassie Blue •R250, G250 … – různá citlivost, rychlost, rozlišení •Fixace gelu: 40%MeOH-20%HAc •Inkubace s Coomassie Blue •Odbarvení pozadí :10%MeOH-10%HacOdbarvení pozadí :10%MeOH 10%Hac •Detekce 3-50 ng proteinu •Jednoduchá, kompatibilní s MS detekcí B í říb•Barvení stříbrem •Dusičnan stříbrný AgNO3 •Ag+ ionty interagují nejvíce s nabitými skupinami Asp, Glu, Cys, His, Lys •Vymytí slabě navázaných iontů a konverze Ag+ na kovové stříbro (formaldehydová nebo l t ld h d á ý jk t bili át )glutaraldehydová vývojka, stabilizátor) •Nejcitlivěší technika – 0,5 ng proteinu •Cross-linky, ireverzibilní, špatná kompatibilita MS d k í i lis MS detekcí, nutno optimalizovat http://www.biomedcentral.com/1741-7007/5/56/figure/F2?highres=y http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3197653_pone.0026495.g002&req=4 Vizualizace proteinů v gelu •Barvení zinkem nebo mědí •Negativní metoda pro SDS-PAGE •Nerozpustné komplexy Zn nebo Cu s•Nerozpustné komplexy Zn nebo Cu s polyakrylamidem vytvářejí mléčné zbarvení okolo míst obsahujících proteiny-SDS, které odpuzuje Zn/Cu •Citlivé – 1 (5-10) ng proteinu •Bez fixace, snadné odmytí barvení, kompatibilní s MS aplikacemip p •Fluorescenční barvy •Krypton Stain, SYPRO-Ruby, Flamingo, Orioleyp , y, g , •Interagují a barví místa s proteiny-SDS • Rychlé, jednoduché • Vysoce citlivé 0 25 1 ng proteinu• Vysoce citlivé 0,25-1 ng proteinu • Nutný nákladný dokumentační systém schopný detekovat fluorescenci (Ex/Em) S d é db í k tibilit• Snadné odbarvení, kompatibilita s navazujícími aplikacemi http://www.lonza.com/ http://www.gbiosciences.com/ResearchProducts/ReversibleZincStain-desc.aspx Vizualizace proteinů v gelu • Specifické fluorescenční barvy •Glykoproteiny (Pro-Q Emerald), fosfoproteiny (Pro-Q Diamond) •Stain-free technologie TGX Stain-Free™ Gels (Bio-Rad) • gel obsahuje speciální trihalo sloučeninu, která se po aktivaci UV zářením váže na rezidua tryptofanu a dochází k vizualizaci barvy • Citlivost podobná Coomassie, kompatibilní nejen s MS, ale i imunodetekcí Dokumentační systémy • Gel Doc • UV-VIS Transiluminátor (event. i epiiluminace) & CCD kamera Klasické výbojky nebo LED excitace• Klasické výbojky nebo LED-excitace •Ex/Em filtry pro fluorescenci • Některé systémy umožňují také snímaní chemiluminiscence ft d it t i ká h d í k tifik i• software pro denzitometrická vyhodnocení a kvantifikaci Vizualizace proteinů v gelu – Bio-Rad Total Protein Stain Sensitivity (Lower Limit) Time Comments Imaging Stain-Free Similar to Coomassie and dependent upon tryptophan No staining or N/A Fast and reproducible; visualize proteins in 5 minutes or less with a stain-free enabled imager; no staining required Coomassie Stains Densitometer Bio-Safe Coomassie G- 8–28 ng 1–2.5 hr Nonhazardous staining in aqueous solution; 250 g g q ; premixed, mass spectrometry compatible Coomassie Brilliant Blue R-250 36–47 ng 2.5 hr Simple and consistent; mass spectrometry compatible; requires destaining with methanol Colloidal endpoint stain; premixed QC Colloidal Coomassie 3 ng 1–20 hr Colloidal endpoint stain; premixed, nonhazardous formulation — no methanol required Silver Stains Densitometer Silver Stain Plus™ Kit 0.6–1.2 ng 1.5 hr Simple, robust; mass spectrometry compatible (Gottlieb and Chavko 1987) Fluorescent Stains CCD and Laser-Based Scanners Oriole Fluorescent Gel Stain* 0.5–1 ng 1.5 hr Rapid protocol, requires no destaining, mass spectrometry compatible; compatible only with UV excitation Flamingo Fluorescent 0 25 0 5 ng 5 hr High sensitivity; broad dynamic range;Flamingo Fluorescent Gel Stain 0.25–0.5 ng 5 hr High sensitivity; broad dynamic range; simple protocol requires no destaining; mass spectrometry compatible; excellent for laser-based scanners SYPRO Ruby Protein Gel Stain 1–10 ng 3 hr Fluorescent protein stain; simple, robust protocol; broad dynamic range; massStain protocol; broad dynamic range; mass spectrometry compatible  Separace proteinů (peptidů) podle jejich izoelektrického bodu (pI)  V pH gradientu proteiny v elektrickém poli migrují do oblasti pH kde V pH gradientu proteiny v elektrickém poli migrují do oblasti pH, kde budou mít celkový nulový náboj (pH=pI) pH gradient vytvořen pomocí amfolytů:  Preparativní IEF – rozdělení proteinů v kapalné fázi do frakcí proteinů v rozmezí určitých hodnot pI  Rotofor (Bio-Rad)  ZOOM (Life Tech) ZOOM (Life Tech)  Agilent OFFGEL  „Analytická“ IEF - v kombinaci s SDS-PAGE„ y => tzv. 2D-ELFO  Metoda „carrier ampholyte IEF“ – amfolyty aplikovány na polyakrylamidový gel vaplikovány na polyakrylamidový gel v trubičce, zafokusovány, následně aplikace vzorku  Immobilizovaný pH gradient IPG – IPG stripy s kovalentně vázanými amfolyty v tenké vrstvě gelu (komerčně dostupné, ready-to-use) http://www.channelwolf.com/lvv/sem6/index_files/Page1942.htm ZOOM IEF Fractionator (LifeTechnologies) MicroRotofor (BioRad) OFFGEL 3100 (Agilent) 1.dimenze - Isoelektrická fokusace – pI 2.Dimenze – SDS-PAGE - MW IPG Stripy (pro různé oblasti pH) Isoelektrický fokusátor pro IPG stripy Možné rozlišení až na úroveň jednotlivých Vizualizace proteinů ve 2D gelu úroveň jednotlivých proteinů d ůIdentita proteinů? Zpravidla LC-MS