Metody sterilní práce.
Očkování a uchovávání mikroorganismů.


Základní pojmy
uBakteriální druh
ujasně vymezená skupina navzájem přibuzných kmenů, zahrnujících typový kmen usdílí 70% a vyšší
DNA-DNA homologii komplementárních párů bází (DNA reasociace) uvykazuje, až na výjimky, shodné
fenotypové znaky a současně má některé odlišné znaky od jiných skupin

Kultura
umikroorganizmy kultivované v laboratorních podmínkách na živných médiích uČistá (jeden druh) x
smíšená (několik druhů) x technická (výskum, provoz) uPřeočkovávaní – přenos kultury na čerstvé
médium (oživení, izolace, odečet vlastností, diagnostika)
uBakteriální kolonie = klon jedné buňky
https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/refphoto/g60_tsa_ecoli_25922_hugo.jpg

Izolace bakteriálního kmene
u= získání čisté kultury
uMohou se využít selektivní média – vyroste jen daný taxon
uMetoda izolace = Křížový roztěr
upostupné zřeďování původní kultury za účelem zisku jednotlivých kolonií (klony jedné buňky). V
místě hádku – rostou už jen jednotlivé kolonie (kmeny), které pak hodnotíme
http://www.crackling.com.au/wp-content/uploads/2013/07/E_-coli-6.jpg

Na jaká média kultury očkovat?
uVe cvičení pracujeme s čistými kulturami získanými z České sbírky mikroorganismů, kultivujeme
podle jejich podmínek uKmeny z prostředí - snažíme se dodržet pro ně přirozené podmínky
(koncentrace soli, živiny, teplota) uZvažujeme aspekty růstu kultury (pracujeme s čistou či
smíšenou kulturou?), zvažujeme limit živin, kyslíku, typ kultivace (stacionární, kontinuální),
homogenitu růstu; odlišně bude probíhat růst v tekutém médiu a na agaru (jiná distribuce živin,
kyslíku)
u

Kultivace
uKultivace - předstupeň izolace, identifikace, stanovení citlivosti na ATB...
uTypy kultivace – pro kultury v tekutém médiu:
uKontinuálně
uchemostat - růstová rychlost kultury je v něm řízena koncentrací limitující živiny, která je
přítokem nového média dodávána
uStaticky
uSubmerzní kultivace  - třepaná nebo vzdušněná (promícháváním se zvětšuje plocha fázového rozhraní
a může probíhat efektivnější výměna plynů)
u

Nároky na teplotu
utermofilní – optimum cca nad 55 °C; extremní termofily rostou kolem 100°C
umezofilní mikroorganizmy
u optimum růstu 20 - 40 °C
u většina bakteriálních druhů; parazitické mikroorganizmy
u Pseudomonas (ale některé její druhy mohou růst i při nízkých teplotách v lednici (4°C)!
upsychrofilní mikroorganizmy
uoptimum růstu méně než 20 °C
uoceány, jeskyně; mohou růst i v ledničce! – např. pseudomonády, aeromonády, listerie

uNároky na tlak – barofilní, barotolerantní
uNároky na živiny
uzdroj uhlíku
u heterotrof – organické látky
u autotrof – CO2
uzdroj energie
u fototrof –světelná energie
u organotrof – organické látky
u litotrof – anorganické látky
uNároky na redoxpotenciál, pH
u

Vztah MO ke kyslíku
uAerobní
uFakultativne anaerobní (aerobně je to pro ně výhodnější energeticky ale nevadí jim anaerobné
prostředí)
uAnaerobní
uStriktně – obligátně anaerobní (kyslík je zabíjí)
uAerotolerantní (přežijí nízke koncentrace, ale O2 NENÍ akceptor elektronů)
uMikroaerofilní – třeba určité % O2, je akceptor
u

FAN – nevadí im anaerobne prostredie, ale kde je prítomný kyslík, zapnú si energeticky výhodnejší
aerobný metabolizmus
AN – kyslík ich zabíja
Aerotol – vedia rásř v nízkych konc. Kyslíka, ale O2 není ich konečný akceptor elektrónov
Mikroaer – Třeba im určité percento kyslíka, je akceptor

Růstová křivka
ugrafické vyjádření závislosti počtu buněk na délce statické kultivace
u(1) Lag fáze
u(2) Fáze zrychleného růstu – fáze fyziologického mládí
u(3) Log fáze – logaritmická – exponenciální
u(4) Fáze zpomaleného růstu
u(5) Fáze stacionární
u(6) Fáze odumírání

Lag – bunky sa prispůsobujú novým podmienkam, prostrediu, médiu, rada ich odumiera
Zrýchl. Rast – už sú nasyntetizované enzýmy, maximálna rýchlosř rastu
Log – intenzívny rast,
Spomalený – znížený metabolizmus, hromadia sa metabolity
Stac – počet vznikajúcich bunek = počet odumírajucich
Odum – menej buniek, kopa metabolitov

Diauxie
upostupné využití substrátu (např. nejdříve využije jednoduchý zdroj - glukóza→první vrchol; potom
teprve nastartuje metabolizmus k využití složitějšího substrátu – laktóza →druhý vrchol)

Uchovávání bakterií
uje nutné zajištění životaschopnosti
una Petriho misce při 4 °C (krátkodobě, nutno přeočkovávat)
uve zkumavce v agaru ve vpichu – měsíce
una šikmém agaru v lednici při +4 °C – týdny
una porézních materiálech - želatinových discích, kuličkách
ulyofilizované – lyofilizace = vymražení vody ve vakuu sublimací vody
uzmražené na – 70 °C po malých objemech v hlubokomrazicím boxu (měsíce, roky)
uboxy s pevným CO2 – suchý led (- 78 °C)
uKryoprezervace - reverzibilní anabióza, neprobíhají biochemické procesy
uzamražení kultur v tekutém dusíku (až - 196°C) nebo v jiných plynech (He, Cr, H), uchovávání
neomezeně dlouho

Postup
uVšechny zkumavky i Petriho misky popíšeme fixou (druh, kmen, datum, své iniciály).
u
uAseptická práce!! Žíhat hrdla a kličky!!! Misky otevírat co nejméně!!!
u
uKaždý pracuje sám – 3 misky, 1 šikmý agar, 1 tekuté médium
u

uPopsat sklo
uZapnout kahan, ožíhat kličku, nechat zchládnout
uNabrat kulturu – tak ¼ kličky
uMalíčkem otevřít vršek, ožíhat zkumavku
uKličku těsně nad okraj hladiny, na stěnu zkumavky, postupně vmíchat do média
uhttps://www.youtube.com/watch?v=NV0TlN0DpPw (od 0:30)
u
u
u
Tekuté půdy

Šikmý agar:
uPopsat sklo
uVyžíhat kličku a nechat zchládnout
uNabrat ¼ kličky
uMalíčkem vršek, ožíhat zkumavku
u „hádek“ na šikmý agar odspodu
u

Petriho misky
u1. křížový roztěr - čistá kultura
uhttps://www.youtube.com/watch?v=AaG3Pt3nwLQ
u2. křížový roztěr směsná kulura G+ a G-
u3. misku rozdělit na čtvrtiny a hádek od okraje ke středu

Křížový roztěr
http://photos1.blogger.com/blogger/3757/4063/1600/M_BI_ES_19.jpg
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/38/Chocolate_agar_1.jpg
http://i.ytimg.com/vi/_1KP9zOtjXk/maxresdefault.jpg

Kultury
uG-
u• Escherichia coli CCM 3954 (fakultativně anaerobní)
u• Pseudomonas putida (aerobní)
u•Serratia marcescens CCM 303 (fakultativně anaerobní)
uG+
u• Kocuria rosea CCM 839 (aerobní)
u• Micrococcus luteus CCM 169 (aerobní)
u• Bacillus cereus CCM 2010 (fakultativně anaerobní)
u• Staphylococcus aureus SA 812 (fakultativně anaerobní)
ukvasinky
u• Saccharomyces cerevisiae (fakultativně anaerobní)