Pozorování kvasinek, vitální test
Cíl: Vitální test – počítání živých a mrtvých buněk
Stanovení % přežívajících buněk
Vitální test
- slouží ke zjištění okamžitého stavu populace
= % živých a mrtvých buněk
(kontrola kvasinek během technologického procesu)
- propustnost membrán mrtvých buněk pro netoxická barviva
(metylénová modř)
→ tabulka (čas, počet živých a mrtvých buněk v 10-ti polích)
graf – závislost přežívajících/mrtvých buněk na čase
Přímé stanovení počtu buněk
• mikroskopicky v Bürkerově komůrce
(skleněná destička s počítací mřížkou)
• prostor mezi podložním a krycím sklíčkem má u různých komůrek
různou hloubku a je na komůrce vždy vyznačen
• při stanovení počtu buněk nejdříve ze známé hloubky komůrky
dopočítáme objem vzorku ve čtverečku a následně počet buněk
přepočítáme na 1 ml
Bürkerova komůrka
(skleněná destička s počítací mřížkou)
!! Počítat jen 2 strany – levou + horní
nebo spodní + pravou
Kvasinky
• heterotrofní eukaryotní organismy
• dle Grama se barví jako G+, ale BS obsahuje chitin, manan,
glukany, proteiny (tedy nejsou Gram-pozitivní)
• mají schopnost zkvašovat mono-, di-, nebo trisacharidy na ethanol a
CO2
• jednobuněčné, pseudomycelium i mycelium
• většinou nízká teplotní odolnost (usmrcení při 2-5 minutovém
zahřívání na 56°C), spory jsou nepatrně odolnější
Kontrola kvasinek
• vitální barvení
• acidifikační test
– rozdíl pH po přidání glukózy do roztoku
Laboratorní x wild type
Využití
• potravinářství (pivo, víno, pekařské droždí, krmná biomasa)
• etanol (Pichia, Candida, Kluyveromyces, Issatchenkia, Rhodotula,
Zygosaccharomyces, Clavispora, Debaryomyces, Metschnikowia,
Cryptococcus, Monilia)
• GMO – rekombinantní proteiny
(HBsAg – vakcína; Pichia pastoris)
• modelový systém (S. pombe, S. cerevisiae, Y. lipolytica) – buněčný
cyklus, biofilm, nádory, metabolizmus léků, sekreční dráhy
Patogenita
• Candida,Cryptococcus, Malassezia a Trichosporon
• ale i Geotrichum, Rhodotula, Saccharomyces, Hansenula anomala
Výroba piva
Buněčný cyklus u kvasinek
Životní cyklus
Saccharomyces
Candida
Kvasinkovitá forma – nepatogenní
Tvorba mycelia – patogenní forma
Schizosaccharomyces pombe
Postup – práce ve dvojici
• Ze suspenze buněk pipetovat 1 ml do sterilní vody
• Z naředěné suspenze pipetovat 1 ml do každé ze 4 zkumavek
• Vzorky budou zahřívány při 60°C po dobu 0; 7; 14 a 21 min
• Stanovení počtu mrtvých a živých buněk v Bürkerově komůrce (nanést
kapku suspenze do komůrky, přikrýt krycím sklíčkem, k okraji přikápnout
methylenovou modř, na opačné straně ji odsát filtračním papírem)
• Po 2 min se buňky usadí, mrtvé jsou obarveny modře
• Pozorujeme při zvětšení 400x
• Spočítat mrtvé namodralé a živé nezbarvené buňky min. v 10-ti čtverečcích
• Postup opakovat pro každý čas
• Z hodnot vytvořit tabulku a graf (v MS exel) závislosti přeživších buněk na
čase (celkový počet buněk – čas 0 min)
Výpočet:
N v 1 ml = součet buněk živých a mrtvých / 10 x 250 x 1000
N = celkový počet buněk