Stanovení citlivosti k antibiotikům. Stanovení koncentrace antibiotik. Antimikrobiální látky uLátky působící celkově: uAntiparazitární látky proti parazitům uAntimykotika proti kvasinkám a vláknitým houbám uAntivirotika proti virům uAntituberkulotika proti mykobakteriím uAntibiotika proti bakteriím (přírodního původu) uAntibakteriální chemoterapeutika také proti bakteriím, ale syntetická u uLátky působící lokálně: uantiseptika http://www.clinicalreviewdisplays.philips.com/images/circle_antimicrobial.png Chemoterapeutika a antibiotika uCHEMOTERAPEUTIKA = chemicky syntetizované látky, které ve velmi nízkých koncentracích (řádově μg/ml) mohou inhibovat nebo usmrtit (citlivé) mikroorganizmy. u uATB = jakákoliv látka přirozeného, semisyntetického nebo syntetického původu, která již ve velmi nízkých koncentracích (řádově μg/ml) může inhibovat nebo usmrtit (citlivé) mikroorganizmy (prostřednictvím specifických inhibičních účinků na specifické děje). Mechanizmy účinku antimikrobiálních látek uInhibice syntézy BS – inhibice syntézy peptidoglykanu, baktericidní účinky na rostoucí bunky (beta-laktamy, glykopeptidy) – penicilíny, cefalosporiny, vankomycin, teikoplanin, bacitracin, cykloserin, fosfomycin uInhibice propustnosti cytoplazmatické membrány – polypeptidy (colistin, polymyxin), antimykotika polyenového charakteru (amfotericin B a nystatin) uInhibice proteosyntézy konkurenčního kmene – baktericidní: aminoglykosidy (30S), bakteriostatické: makrolidy (50S), tetracykliny (30S), linkosamidy (50S), amfenikoly (50S) uInhibice syntézy nukleových kyselin – interference s DNA bakterií (chinolony - vyvázání gyrázy, nitroimidazoly) a s RNA (vyvázání RNA polymerázy - ansamiciny, rifampicin - mRNA) uAntagonismus a kompetitivní inhibice, antimetabolity – bakteriostatické – sulfonamidy, trimetoprim, dapson, izoniazid Posobia na prokaryotické struktury, nie na eukaryotické Antibiotika uAntibiotika = sekundární metabolity mikroorganizmů, slouží pro potlačení růstu konkurenčních MO uPřirození producenti antibiotik: Penicillium, Aspergillus, Acremonium, Cephalosporium, Scopulariopsis… uPrvní antibiotikum – penicilín, produkovaný plísní Penicillium (Alexander Fleming, 1928), druhé streptomycin produkovaný aktinomycetou rodu Streptomyces http://thumbs.media.smithsonianmag.com/filer/Alexander-Fleming-penicillin-631.jpg__800x600_q85_crop .jpg uPřirozená a modifikovaná; úzko a širokospektrá; lokálně, orálně nebo injekčně podávaná uVedlejší účinky: toxicita, sekundární infekce poškozením vlastní mikroflóry AF nebol zrovna najporiadnejsi, nechaval otvorene misky a mal bordel v labine..potom siel domov na sviatky a zabudol dat vysterilizovat pouzite misky a nechal otvorene okno. Kde sa vratil zistil ze kopa misiek bola plesniva. Kde isiel povyhadzovat tie stare misky, tak si vsimol ze na niektorych miskách kde mal stafylokoky boli okolo plesní prejasnené časti misiek, neboli tam baktérie a něco ich zabilo. Odložil si miksy a začal ich skúmat, no moc mu to nešlo a až neskůr iný vedci sa začali zaberat penicilínom (Florey a Chain‘ Rezistence uPrimární – vyplývá z přirozených vlastností buňky: chybějící receptor, transportní systém, či cílové místo AB uSekundární – získaná, způsobená spontánními změnami v genomu mutacemi či přenosem genetické informace uStafylococcus, Escherichia, Klebsiella, Enterococcus, Mycobacterium, Salmonella, Proteus uMultirezistentní kmeny uProblémy – nevhodné anebo zbytečné užívání antibiotik (viry), ukončení léčby po vymizení symptomů, snaha farmaceutických firem o prodej, preventivní podávání AB zvířatům ke zvýšení produkce https://s-media-cache-ak0.pinimg.com/236x/3a/46/a0/3a46a0fecf4a1e2712d1c2cda62f3c8d.jpg Už Fleming varoval před opatným zaobchádzaním s antibiotikami, už od roku 1945 sa začali objevovat pneumonie a soky vyvolané rezistentními zlatými staylokomi. Fluorochinolony zaviedli a zabíjali 95% meticilin rezist. Staf, a o rok na to uz bolo 80/ staf. rezistentných Hodnocení účinku ATB uDůležitými kritérii pro zhodnocení účinku ATB jsou jeho koncentrace, doba kontaktu a je-li pro bakterii letální (baktericidní) nebo jen dočasně inhibuje růst (bakteriostatické) u uPro medicínu je důležité určit citlivost mikroorganizmu k ATB – umožní to identifikaci Souhrn testů citlivosti bakterie na ATB se nazývá antibiogram u uPro kultivační testy citlivosti k ATB se využívá speciální Mueller-Hinton agar Má nižší obsah ztužovadla pro lepší difúzi antibiotika agarem. u uUrčení MIC – minimální inhibiční koncentrace ATB – je to zřeďovací metoda, provádí se buď ve zkumavce nebo na mikrotitrační destičce MIC = nejnižší koncentrace antimikrobiální látky, při které ještě nepozorujeme růst bakterie Stanovení citlivosti a rezistence na ATB - kvantitativně uKvantitativní diluční E-test – papírek napuštěný klesající koncentrací ATB se položí na misku s kulturou, sleduje se projasnění nárůstu a hodnota MIC u Etest223 http://www.biomerieux-industry.com/sites/industry/files/styles/large/public/etest-antibiotic-suscep tibility-testing.png https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQ3ghZuDM6kRZDbPg0b4CLEXjGrnqdalg1XW5YzfGPXOFf 1sAboeA Stanovení citlivosti a rezistence na ATB - kvantitativně uMikrodiluční test uMikrotitrační destička s jamkami, kde postupně klesá koncentrace ATB uUrčuje MIC (nejnižší koncentrace co inhibuje mikroorganizmus) http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap20/20-19_Microdilution_1.jpg Stanovení citlivosti a rezistence na ATB - kvalitativně u1. kapková metoda – ATB se kape na povrch tekutého média s kulturou u2. disková metoda – na agarové plotny s naočkovanou kulturou se kladou disky nasyceny antibiotiky. Měří se průměry inhibičních zón, které se interpretují podle tabulek hraničních hodnot rezistence u 06-07 http://www.cysonline.org/articles/2012/3/4/images/ChronYoungSci_2012_3_4_292_103098_u8.jpg Stanovení citlivosti a rezistence na ATB - kvalitativně u3. komínková metoda – do agaru se vtlačí komínky, do nich se pipetují roztoky ATB u4. jamková metoda – do jamek v agaru se pipetují roztoky ATB u Stanovení citlivosti a rezistence na ATB uTest synergizmu - testování na produkci širokospektrých betalaktamáz (enzymy inhibující betalaktamové ATB) uvyužívá se difúze klavulanové kyseliny od disku obsahujícího ko-amoxicilin https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQ6DOLHBecL2j6yi9eJ6D8xNjRwXTYloL5hRoXXeBm5skd IcPc4 http://image.slidesharecdn.com/laboratorydetectionand-110611214718-phpapp02/95/laboratory-detection -of-esbl-29-728.jpg?cb=1307829026 Betalaktamazy su enzymy co inhibuju betalaktam. Atb, napr penicilin. ATB maju stvoratomovy kruh a betalaktamazy ho otvaraju Stanovení citlivosti k ATB difuzním testem – disková metoda uTestovaný kmen se rovnoměrně rozetře po povrchu agaru a na roztěr se nakladou papírové disky napuštěné antimikrobiální látkou uBěhem kultivace difunduje látka z disku horizontálně do okolního agaru v koncentračním gradientu. uÚčinná látka se projeví vytvořením kruhové, tzv. inhibiční zóny kolem disku. uCitlivost mikroorganizmu k testované látce se určí z velikosti inhibiční zóny. http://www.medicalobserver.com.au/assets/images_20nov2012/07-06-13-inside-story-m8740010.jpg Postup – disková metoda uNa agar rozetřít hokejkou kulturu (0,2 ml) a nechat zaschnout uSterilní jehlou rozložit disky s ATB uKultivovat 24 – 36 h, 37°C uSledujeme velikost inhibičních zón vytvořených kolen disků uZóna 5 - 11 mm = citlivý mikroorganismus uZóna nad 12 mm = velmi citlivý organismus u http://www.bugblog.net/bugblog/Bug_Round_11/Entries/2011/3/11_All_that_glitters..._-_Staphylococcus _aureus_files/shapeimage_7.png Stanovení koncentrace ATB – difuzní jamková metoda uDo jamek na agaru s kulturou se napipetuje roztok antibiotika o známé koncentraci uPo kultivaci se okolo jamky vytvoří inhibiční zóna uZ hodnot průměrů zón rezistence kolem jamek se standardními roztoky se sestrojí kalibrační přímka sledující závislost průměru zóny v mm na logaritmu koncentrace uZ kalibrační přímky se stanoví neznámá koncentrace vzorků antibiotika Postup – difuzní jamková metoda uNa misku s Mueller-Hinton agarem naočkovat kulturu S. aureus, nechat ztuhnout uPřipravit standardní ředící řadu ATB (250, 125, 62,5, 31,25, 15,625, 7,81 μg/ml) uPopsat misky – vždy 1 miska = 1 koncentrace u+ 1 miska vzorek o neznámé koncentraci uDo misky vyvrtat 4 jamky sterilním korkovrtem (etanol a ožehnutí), agar odkládat do Petriho misky – infekční! uDo každé jamky napipetovat 40 μl dané koncentrace roztoku ATB uOpatrně zacházet, nevylít roztoky uKultivovat 24h, 37°C u Hodnocení uDisková metoda uZměřit inhibiční zóny – měří se průměr včetně disku uDo 11 mm – necitlivý mikroorganizmus u11 – 17 mm – citlivý uNad 17 mm – velmi citlivý u uJamková metoda uZměřit 4 zóny na misce (v mm) a vypočítat průměr uSestrojit kalibrační křivku – průměr zóny v mm/log koncentrace uUrčit koncentraci neznámého vzorku u http://oceanexplorer.noaa.gov/explorations/04etta/background/antimicrobial/media/enrofloxacin_600.j pg