Pozorování bakteriálních endospor a negativní barvení



Bakteriální spory
uVegetativní buňka → endospora = odolné klidové stádium buňky
uVzniká jen jedna endospora
uSpory jsou odolné k UV a γ záření, lyzozymu, vyšším teplotám, nedostatku živin, dezinfekcím
uSpecifický peptidoglykan, specifické bílkoviny, snížené množství vody, zvýšený obsah vápniku
uSporulace je příprava bakterie na nepříznivé podmínky, NE ODPOVĚĎ na ně uTvoří je převážně G+
bakterie – Bacillus, Clostridium, Sporosarcina…
uVýjimečně G- (Coxiella burnetii)
u
u
u
http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/en/nurse/Associate%20Degree%2
0Nursing/ptn/Microbiology/1/02%20Morphology%20and%20structure%20of%20bacteria.files/image016.jpg
https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS2GOTrkgdRl2RqdRgAqOm60JJp5sHUjzwsOAXvoof58a4
NLglA http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&task=download&id=8232
http://ichef-1.bbci.co.uk/news/304/media/images/71629000/jpg/_71629716_c0052632-endospores_in_bacil
lus_subtilis_bacteria-spl.jpg
http://www.corbisimages.com/images/Corbis-42-24897863.jpg?size=67&uid=6fbde594-c075-466a-a69e-84d56
4d84efc

Bakteriální spora - stavba
uProtoplast (sporoplast) – gelová matrix, nukleoid, ribozomy, kalcium dipikolinát, proteiny
stabilizující DNA
uVnitřní membrána (intina) z lipoproteinů
uVrstva peptidoglykanu – zbytek původní buněčné stěny
uKortex – vnitřní a zevní, zajišťuje nepropustnost a odolnost, termorezistenci, tvořen
peptidoglykany – jinými než v buněčné stěně
uVnější membrána (extina)z lipoproteinů
uPlášť  - zajišťuje odolnost k chemikáliím a UV
uExospórium – není u všech taxonů, zajišťuje odolnost
u
Endospore

Proteíny sú pevne zviazané s nukleovou kyselinou a zabezpečujú jej kondenzáciu a rezistenciu voči
UV a DNA-ničiacich látok
Intina bráni prestupu chem. Látok z prostredia
/Peptifoglykan. Základ budúcej bun.steny při klíčení

Sporulace – vznik endospory
uProbíhá i při dostatku živin, hlavně v stacionární fázi
uFáze I – Buňka přechází z binárního k asymetrickému dělení
uFáze II – Chromozom se duplikuje a odděluje
uFáze III – DNA se rozestoupí k pólům buňky. Vytváří se septum, rozdělí buňku na 2 nestejné části –
presporu a sporangium.
uFáze IV – prespora se obalí dvěma membránami . Tvoří se prospora. Není světlolomná.
uFáze V – tvoří se kortex spory s jiným peptidoglykanem.  Je přítomen kalcium dipikolinát (kalcium
+ kys. dipikolinová tvořena mateřskou buňkou). Endospora už je světlolomná.
uFáze VI – syntéza pláště, u rodu Bacillus vzniká exosporium
uFáze VII – Maturace endospory, lyze mateřské buňky, uvolnění zralé spory.
u
u
http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&task=download&id=8232

u



sporulace probíhá i při dostatku živin, hlavně však ve stacionární fázi
během sporulace modelového mikroorganizmu B. subtillis můžeme rozlišit 7 fází (I –
VII), jež lze charakterizovat morfologicky a na molekulárně biologické úrovni; za
proces vzniku endospory zodpovídá 50 genů a trvá průměrně 6 – 7 hodin
proces začíná ve fázi G1, v průběhu vzniku přepážky (na konci G1) je již jasné, zda
vznikne vegetativní buňka nebo spora, buňka přechází od binárního dělení k dělení
asymetrickému
v místě přepážky se dvojitě vchlípí cytoplazmatická membrána
prospora se utváří v tzv. sporogenní zóně
primárně se přepisují geny, které připraví prostor pro sporu, zvyšuje se kvantum
volutinu (= první známka sporulace, zvýšené množství volutinu zjistíme jeho
nabarvením)
druhým signálem sporulace je zvýšení množství enzymů; buňka zvyšuje spotřebu
acetátu, zvýšení počtu enzymů Krebsova cyklu a hydroláz
na procesu sporulace se podílí amylázy, proteázy, fosfatázy, DNázy
Začíná spontánní aktivací spory.
Aktivace začíná destabilizací pláště, v laboratorních podmínkách při působení teploty 70-85
°C po 5 – 10 minutách, dalšími aktivátory jsou malé organické molekuly – aminokyseliny,
vitaminy, zvýšení počtu bazí, L-Ala, Ado a Ino. Aktivovaná spora přijímá vodu a ztrácí
rezistenci – bílkovinné stabilizátory jako vnitřní součásti se začínají rozkládat, vzniklé
aminokyseliny slouží jako stavební kameny nových proteinů. Nejprve ovlivněna
proteosyntéza (hlavně degradační enzymy – proto ve spoře dostatek Mg). V momentě, kdy
buňka tvoří energii, začíná fungovat regulační aparát chromozomu (ATP = signál aktivace
chromozomu). Prvními funkčními enzymy jsou glykosidázy – metabolizování kortexu, poté
rozklad extiny (fosfolipidy+bílkovina+polysacharid). Lytický enzym: p68 => p29
(kortikohydroláza) – depolymerizuje kortex pro nástupný průnik vody. Po dvou hodinách po
germinaci spory následuje dělení vegetativní buňky.
Podle lokalizace klíčení spory rozeznáváme germinaci terminální (na pólech buňky) a
centrální. Germinaci je možné inhibovat přítomností aminokyseliny D-Ala, MgCl2,
inhibitorem proteáz - fenylmetylsulfonylfluoridem PMSF.

Klíčení spory = germinace
uSpora se aktivuje spontánně, zahřátím, fyzikálními nebo chemickými faktory, přítomností vody,
aminokyselin, vitamínů uKlíčení = přijímání vody, hydrolýza kortexu, ztráta rezistence
uDestabilizuje se plášť, spora přijímá vodu, ztrácí rezistenci, syntetizuje enzymy, spouští se
proteosyntéza, regulační procesy, metabolizmus uPo dvou hodinách od germinace se vzniklá
vegetativní buňka dělí
f3-45_endospore_germina

Bielkovinové stabilizátory sa rozpadaju a zo vzniknutých aminokyselin vznikaju nove bielkoviny

http://images.fineartamerica.com/images-medium-large/clostridium-difficile-bacteria-tem-biomedical-
imaging-unit-southampton-general-hospital.jpg
Bakteriální endospory
uTvar a umístění spory v  buňce napomáhá k identifikaci bakterií
u
uOválné - Bacillus anthracis, B. cereus, Clostridium botulinum
uKulaté - Clostridium tetani, Bacillus sphearicus
u
uTerminální - C. tetani
uSubterminální (paracentrální) - C. botulinum
uCentrální - B. cereus, B. anthracis
u
uSpory vyklenují/nevyklenují buňku

Bakteriální endospory
uSpory jsou velmi odolné, např. Clostridium botulinum odolá 90 minut při 100°C (nesporulující buňky
hynou při 70°C, 30 minut) uSporocidní látky – ethylenoxid, betapropionlakton, koncentrované louhy a
kyseliny, formaldehyd, Persteril (kys. peroctová), jodové preparáty, chloramin
u
uSpory Bacillus anthracis – antrax, bioterorizmus
uBílkovina ze spor Bacillus thuringiensis – biopesticidy
uModifikované spory Bacillus subtilis  - vehikula vakcín
u
u
https://www.learner.org/courses/biology/images/archive/fullsize/1022_fs.jpg
http://i00.i.aliimg.com/img/pb/300/480/580/580480300_068.jpg
Bacillus thuringiensis

Bakteriální pouzdro
uPolysacharidové či bílkovinové pouzdro lemuje bakteriální buňku, chrání jí proti vysychání ,
jedům, imunitnímu systému
uAdherence, biofilm, rezistence k antibiotikům, faktor virulence
uBakterie tvořící pouzdra tvoří slizové, mukózní, kličkou tahavé kolonie, které znázorníme
negativním barvením
uVysoké množství sacharidů v médiu podporuje tvorbu pouzdra
u
http://pinkava.asu.edu/starcentral/microscope/msr/rawdata/viewable/bacteria_1097852068_esmlaw.jpg

Pozorování spor
uNeobarvené spory (nativní preparát) pozorujeme fázovým (zářící spory) nebo Nomarského kontrastem
(plastický povrch) uJednoduchým barvením se barví jen buňková stěna, nevidíme spory, jen vyklenutí
buňky uEndosporu obarvíme za horka.  Spory špatně přijímají barvivo, proto se obarví až během varu
u
uNegativní barvení
uObarví okolí buněk (pozadí, sklíčko), ne buňky samotné
uBuňka se nedeformuje barvením ani fixací
https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRPojy6VqFD3ftBbdqzYryWC0u8H-oTnNlWpZIS_1cu2rJ
XSs5EhQ
http://image.sciencesource.com/preview/3C1989-Ochrobactrum-anthropi-Bacteria.jpg
http://textbookofbacteriology.net/Bacillus.spore.CDC.jpeg

Kontrast – pozorujeme skutocny tvar bunky a struktury bunky, rast, mnozenie, pohyb, fázový kontrast
– využíva odlišnú svetlolomnost castic, rozne indexy lomu
Jen vyklenutí bunky sposobené pritomnostou spor, priamo by ich slo ofarbit keby si vytvorime
protosporu, kde ma kortex ide to iba za horka alebo s koncentrovanymi farbami

Pozorované bakterie
uBacillus
uG+ tyčky, sporulují, tvoří řetízky buněk
uBiozbraně až tvorba antibiotik
u
u
u
uAzotobacter
uG- tyčka až kok
uTvoří pigment, sliz, pouzdra, cysty
uNesymbiotická fixace dusíku
http://inst.bact.wisc.edu/inst/images/book_3/chapter_11/11-12.jpg
http://bacmap.wishartlab.com/system/images/115/medium/Bacillus_anthracis.jpg?1319706220

Spory rodu Bacillus
uB. Sphaericus
ukulaté, terminální, ztlušťují buňku
http://aem.asm.org/content/66/10/4449/F4.large.jpg
http://textbookofbacteriology.net/Bl.Bl.bp.sporesDOA.jpeg
B. thuringiensis
oválné, subterminální, nevyklenují
B. cereus
centrální, oválné, nevyklenují
B. megaterium
Kulaté
Subterminální
Nevyklenují
Paenibacillus polymyxa
Velké centrální
Vyklenující

Práce ve cvičení
uNativní preparát - fázový kontrast
Negativně barvený preparát
Obarví okolí buněk
Nigrosin Kongo červeň
Obrázky – druhá prezentace

Postup
uNativní preparát – Bacillus – každý svůj preparát
uSklíčko protáhnout plamenem, doprostřed nanést kapku vody
uOžehnutou kličkou vnést do kapky kličku kultury a rozmíchat, přikrýt krycím sklem aby tam nebyly
bubliny, přebytečnou vodu odsát
uPozorovat do 5 minut fázovým kontrastem (1000x)
uJe vidět tvar a umístění spor, pohyb
u
uNegativní barvení – nigrosin – Bacillus nebo Azotobacter– každý svůj preparát
uDo kapky vody rozmíchat vyžíhanou kličkou trochu kultury
uPřidat kapku nigrosinu
uRozmíchat kličkou, rozetřít jemným tahem druhého sklíčka (pod 45º uhlem) a nechat zaschnout bez
oplachování
uPozorovat s imerzí v jasném poli (1000x)
uJe vidět přesná velkost a tvar buňky
cereusnegrosin

Postup – barvení pouzder
uBarvení pouzder – Kongo červení – Azotobacter – ve dvojici
uDo kapky Kongo červeně nanést kulturu a rozetřít po sklíčku
uNechat zaschnout, na několik sekund převrstvit HCl, tu následně slít, neoplachovat, pouze  dosušit
preparát filtračním papírem
uNa 3 minuty převrstvit metylenovou modří, opláchnout, usušit
uPozorovat s imerzí v jasném poli (1000x)
uVidíme modré buňky, světlá pouzdra a modré pozadí
u
uBarvení pouzder – nigrosinem, dobarvení modří – Azotobacter -  ve dvojici
uKapka vody + kapka nigrosinu, do toho nanést vyžíhanou kličkou kulturu a rozetřít po sklíčku,
nechat zaschnout
uPřevrstvit na 3 minuty metylenovou modří, opláchnout, osušit
uPozorovat s imerzí v jasném poli (1000x)
uVidíme modré buňky obklopeny světlými pouzdry, pozadí tmavé