Mikroskopické houby - cvičení Obsah: 1. Izolace mikroskopických hub - metoda přímého výsevu 2. Izolace mikroskopických hub - ředící metoda 3. Izolace mikroskopických hub sterem z prostředí 4. Izolace vodních hyfomycet 5. Izolace mikroskopických hub z osiva (seed born fungi) 6. Příprava čisté kultury 7. Příprava mikrokultury (sklíčkové kultury) 8. Identifikace vláknitých hub rodu Aspergillus 9. Identifikace vláknitých hub rodu Penicillium 10. Identifikace vláknitých hub rodu Fusarium 11. Identifikace vláknitých hub řádu Mucorales 12. Nativní preparát - mikroskopování 13. Seznam médií používaných v mykologii -1/36- 1. Izolace mikroskopických hub - metoda přímého výsevu Materiál: koření, bylinné čaje Pomůcky: pinzeta, kultivační médium (MA2% - Malt Extrakt Agar s chloramfenikolem, DRBC), termostat na 25 °C Pracovní postup: 1. Vzorek rovnoměrně rozprostřeme po povrchu kultivačního média. 2. Kultivujeme ve tmě, při teplotě 25 °C po dobu 7 dnů. 3. Mikroskopování, identifikace Úkoly: Proveďte rodovou či druhovou identifikaci izolátů. 2. Izolace a kvantifikace půdní mykoflóry ředící metodou Princip: Půdní vzorek určitého objemu roztřepeme ve standardním objemu sterilní vody a dále ředíme. V několika ředěních vyséváme na misky s agarovou půdou. Metoda vychází ze základního empiricky ověřeného předpokladu, že z 1 životaschopné buňky vyrůstá 1 kolonie. Životaschopné buňky vytvářejí na agarovém živném mediu viditelné makroskopické kolonie. V případě izolace a kvantifikace půdní mykoflóry se používá např. půdní agar s glukosou a bengálskou červení, která má antibakteriální účinek a snižuje rychlost růstu hub. Materiál: půda Pomůcky: zkumavky se sterilní vodou, špičky, automatické pipety, kultivační médium (SEA - Soil Extract Agar - Půdní agar s glukosou a bengálskou červení), L-klička, třepačka, termostat. Pracovní postup: 1. Připravíme výchozí suspenzi vzorku v 9 násobku sterilní dest. vody. Homogenizujeme ručně nebo na třepačce 10 - 20 min. 2. Pomocí pipety z výchozí suspenze přeneseme 1 ml do zkumavky s 9 ml ster. destilované vody. Dobře promícháme! Tento postup opakujeme až -8 k dosažení ředění 10" . -6 -7 -8 3. Z ředění 10,10" a 10" vykápneme pomocí pipety 100 |il na povrch pevného média (obr. 1) a L-kličkou rozetřeme rovnoměrně po celém povrchu pevného média. 4. Kultivujeme při teplotě 25 °C po dobu 1 týdne. -2/36- 5. K hodnocení vybereme nejvhodnější ředění (20 - 200 kolonií na misce) a spočítáme kolonie 6. Vypočítáme hodnotu CFU (Colony Forming Unit) v 1 g vzorku. Výpočet: Celkový počet kolonií vynásobíme ředěním a 10ti (pipetovali jsme 0,1 ml na misku). Celkový počet mikroorganismů .Y na g vzorku se vypočte podle vztahu N = —- -— součet všech kolonií spočítaných na vybraných plotnách, objem inokula aplikovaného na misku v ml, n* počet ploten použitých pro výpočet z pivního ředění, počet ploten použitých pro výpočet z druhého ředění, faktor prvního pro výpočet použitého ředění. Úkoly: Proveďte rodovou či druhovou identifikaci izolátů. Vypočítejte hodnotu CFU. -3/36- Nepřímé stanovení počtu živých buněk v 1 g vzorku - METODA ROZTĚREM NA PLOTNU lg 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml -4/36- -5/36- 3. Izolace mikroskopických hub sterem z prostředí Materiál: stěr z prostředí (např. okenní rám, žaluzie, odpadkový koš, klávesnice počítače, aj.) Pomůcky: lx sterilní vatový tampon, 2x Petřino miska s MA 2% (agar se sladovým extraktem + chloramfenikol), termostat na 25 °C Pracovní postup: 1. Sterilní vatový tampón zvlhčíme přetřením povrchu agaru. 2. Sterilním vatovým tampónem přetřeme odběrové místo. 3. Sterilním vatovým tampónem přetřeme celou plochu Petriho misky s agarem. 4. Kultivujeme 7 dnů při teplotě 25 °C. Úkoly: Podle identifikačního klíče proveďte rodovou či druhovou identifikaci. 4. Izolace vodních hvfomycet Materiál: rostlinný materiál (opadané listí, větvičky na vodní hladině) odebraný z vodního toku do plastového sáčku Pomůcky: kádinka (zavařovací láhev), Petriho miska se sterilní dest. vodou, pinzeta, termostat na 15 °C Pracovní postup: 1. Materiál necháme v laboratoři promývat 1 hod. pod tekoucí vodou. 2. Části rostlinného materiálu přemístíme do Petriho misky s destilovanou vodou. 3. Kultivujeme několik dní při 15 °C a pod mikroskopem kontrolujeme tvorbu konidií. 4. Provedeme identifikaci dle klíče Úkoly: Podle identifikačního klíče proveďte rodovou či druhovou identifikaci. -6/36- 5. Izolace mikroskopických hub z osiva (seed born fungi) Materiál: obilky pšenice Pomůcky: 2% roztok dezinfekčního přípravku SAVO, minutky, sterilní detilovaná voda, sterilní pinzeta, sterilní Petriho miska s filtračním papírem nebo kultivační médium (PDA - potato dextrose agar) Pracovní postup: 1. Provedeme povrchovou dezinfekci vložením 5 obilek do 2% roztoku dezinfekčního přípravku SAVO (tj. 0,1 % NaClO) na dobu 10 minut. 2. Poté osivo třikrát opláchneme sterilní destilovanou vodou. 3. Sterilní pinzetou rozmístíme obilky na povrch PDA (viz. schéma). 4. Kultivujeme ve tmě, při teplotě 25 °C po dobu deseti dnů. 5. Mikroskopické hodnocení Úkoly: Proveďte rodovou či druhovou identifikaci. 6. Příprava čisté kultury Materiál: Petriho misky se smíšenou kulturou Pomůcky: preparační jehla, Petriho miska s médiem, termostat na 25 °C Pracovní postup: 1. Vyžíhanou preparační jehlou přeneseme část mycelia nebo spor na agarovou plotnu nebo do sterilní vody ve zkumavce k získání suspenze, kterou můžeme dále ředit a poté vysévat na agarovou plotnu. 2. Kultivujeme 7 dnů při teplotě 25 °C. -7/36- 7. Příprava mikrokultury (sklíčkové kultury) Materiál: Petriho misky s kulturou vláknité houby Pomůcky: preparační jehla, Petriho miska s vhodným kultivačním médiem (Malt Extrakt Agar nebo Sabouraudův glukozový agar), sterilní pinzeta, sterilní destilovaná voda, sterilní krycí a podložní skla, sterilní Petriho miska (vlhká komůrka). 1. Z tenké vrstvy kultivačního média připravíme bloček o velikosti lxl cm. 2. Bloček přeneseme na sterilní podložní sklo umístěné ve vlhké komůrce. 3. Vpichem do čtyř stran naočkujeme kulturu a překryjeme krycím sklem. 4. Kultivujeme 2 - 5 dní při teplotě 25 °C. 5. Průběžně sledujeme růst suchým objektivem při zvětšení 60x - 450x. Pracovní postup: físxro&tlcL kulíu.rcu -8/36- 8. Identifikace vláknitých hub rodu Aspergillus Materiál: Petriho misky s kulturou Pomůcky: preparační jehla, Petriho miska s CYA (Czapkův agar s kvasničným extraktem), MEA (Agar se sladovým extraktem), CY20S (Czapkův agar s kvasničným extraktem a 20% sacharosy), termostat Pracovní postup: 7. Povrch příslušných médií inokulujeme konidiemi vláknité houby formou vpichu na třech místech tvořících vrcholy rovnoramenného trojúhelníka (body mají být vzdáleny asi 3 cm od kraje misky). Aby se spory při očkování nerozptýlily po celé půdě, očkujeme misky zespodu, otočené dnem vzhůru. 8. Kultivujeme 7 dnů při teplotě 25 a 37 °C._ _ Schéma inokulace: Hodnocení: po 7 dnech kultivace provedeme vyhodnocení růstu vláknitých hub. Sledujeme: znaky makroskopické • rychlost růstu • charakter povrchu kolonií • barvu kolonie • barvu spodní strany kolonie • přítomnost pigmentu difundujícího do agaru • přítomnost a barvu výpotku (exudát) • přítomnost zvláštních útvarů viditelných okem (plodničky, sklerocia, aj.) • charakteristický zápach. -9/36- V hodnocení vždy uvedeme stáří kultury a použitou kultivační půdu, neboť různé půdy mnohdy modifikují a značně mění charakteristické znaky (jak makroskopické, tak mikroskopické). Čisté kultury připravujeme zpravidla na půdě, na které je popis rodu autorem uveden. znaky mikroskopické Ke zjištění mikroskopických znaků nutných pro identifikaci vláknitých hub potřebujeme kromě mikroskopu i binokulární lupu. Pod lupou prohlédneme větší struktury (charakter mycelia, sklerocií, plodniček apod.), pro studium dalších struktur, na nichž je založena identifikace, připravíme mikroskopický preparát. Jeho příprava a správné posouzení a zhodnocení je mimořádně důležité, neboť morfologické znaky u vláknitých hub jsou základním diagnostickým kritériem při určování rodů a druhů. Identifikace do rodu či druhu na základě makroskopických a mikroskopických morfologických znaků se provádí podle klíčů vypracovaných pro určité taxonomické skupiny. uniseriátní biseriátní komdiáMhiavice sloupcové Úkoly: Popište veškeré znaky do identifikačního protokolu Podle identifikačního klíče proveďte druhovou identifikaci. -10/36- Příloha VI Aspergillus sek fíalidv prim. Fialidy michyfek konidiofor 1 Obr. 1. Kiir.i.linli.r J ii ri)llll \ pí il'ill'i (podii' I(.i|i.tii a I1 ni ■■II.w i'i a ukoncVní konidiiifuiu m jednou Inilou flulíd, b uliiinřiiuií koniilinfnru *• i.i'kiIIii« (pudln Arxc) Obr. ň, Vrřrku u nulu Am[km'HÍ1Iuh (pudle Arx<>) Obr. (i. Atiki' i J l il Thnllia) a Mimovi'itKnllnln. h fiivci 1 ui I lutu FIG. 5. Penicilli of the simplest and most complex types normally encountered in Pentctt- AHymmotrica Hum species. Oitr. 'J. Kimidinftir u rutin IVmcdliiitn (Mi vi»rl tail lata Symmetrica) (podle lia-|H'in a Thoma) Otir. Koniilmfoiy n rndu TVnicillium (A-cymmntnca Divartaata) {pndta Rapcra a Thnma) -14/36- :órod Aspergilloides podrod Penicilli um podrod Bivertícillium iiofor mocoverticiláíní konidiofor asymetricky větvený konidiofor biverticilátně terverticiláíní symetrický podrod F urcatum konidiofor divarikátní Jbr. 3 - Schematická znázornení typů konidioforů u rodu psnicillium -15/36- 10. Identifikace vláknitých hub rodu Fusarium Materiál: Petriho miska s kulturou na PDA (bramborodextrozový agar) Hodnocení: po 10 dnech kultivace při 25 °C I. znaky makroskopické, které určíme z charakteru růstu • rychlost růstu • barvu kolonie • barvu spodní strany kolonie • přítomnost zvláštních útvarů viditelných okem (sporodochia, sklerocia) II. znaky mikroskopické, které zjistíme pomocí nativního preparátu • makrokonidie - tvar bazálni a apikální buňky, mikrokonidie, chlamydospory • typ fialid (monofialidy, polyfialidy) Úkoly: Popište veškeré znaky do identifikačního protokolu Proveďte druhovou identifikace. MiMlllll <»(.K kí SIKI Kil IO ť HOIHI HSAKIIM irnYiikonKlic mikroknmdie chlamydmpury sklcroCM makrokonidie -16/36- 11. Identifikace vláknitých hub řádu Mucorales Materiál: Petriho miska s kulturou Hodnocení: III. znaky makroskopické, které určíme z charakteru růstu IV. znaky mikroskopické, které zjistíme pomocí nativního preparátů Úkoly: Popište veškeré mikroskopické znaky. Proveďte identifikaci do rodu. Charakteristické znaky řádu Mucorales Zástupci tohoto řádu vytváří řídce vato vité nebo plstnaté vzdušné mycelium velmi rychle rostoucí. Stélku těchto hub tvoří převážně mnohojaderné mycelium bez přehrádek a proto je zvláště u mladého mycelia dobře pozorovatelné proudění plazmy. Přepážky se vyskytují pravidelně pod rozmnožovacími orgány a ve stáří nepravidelně v průběhu mycelia. Pro rozlišení rodů a druhů řádu Mucorales se používají především znaky nepohlavního rozmnožování, které se uskutečňuje sporangiosporami vznikajícími ve sporangiích vyrůstajících na zvláštních vláknech - sporangioforech. Mucor - sporangiofory jsou ukončeny sporangii bez apofýzy, s kolumelou kulovitou, oválnou nebo hruškovitou. Rhizopus - sporangiofory se tvoří obvykle ve svazcích a nebývají větvené. Vznikají na výhoncích (stolonech), které tvoří velmi často na pevném podkladu rozvětvené, tmavě hnědé rhizoidy. Kolumela má vyvinutou apofýzu. Po prasknutí sporangiální stěny se kolumela s apofýzou kloboukovitě obrací. Rhizomucor - sporangiofory bývají větvené. Přítomny stolony a hnědé rhizoidy. Absidia - sporangiofory vyrůstají ve svazcích na výhoncích s rhizoidy. Kolumela kuželovitá, často má na vrcholu papilu nebo ostřejší výčnělek. Sporangiofor přechází do sporangia širokou apofýzou. -17/36- Příloha II Mucorales Obr. I. Tvorba sygoii|>or) u Muouralm (orig.) d Hi'tkiiiij kmii'i'i íl minim myi'i'lil. h 7.\'Hi'liL, <■ 7.VK<>H|Mirii Obr. 'J. MiiiiliiiH|iiiriľkó H|p%iianj'. Munir (ni'JK.) Obr. 3. f'Änt H|iiiriin^ii)ľi>rii no »[hhiuikIo liimi u rudu "ľliii j 11 n ■ i I ■ i i i ■■ (podln Zyohy) Ohr. 4. S|Miľiiii^niiii m iipiifyriiu n kolu- moloU II milll \li nli:i (li| v plodnicích pak dochází ke karyogamii v koncových buňkách tzv. askogenních hyfách - z nich vznikají vřecka - spory (askospory) vznikají ve vřecku (latinsky ascus, množné číslo asci) obvykle v počtu 8 v jednom vřecku -33/36- Typy plodnic: 1) Askohymeniální typ - kleistothecium je uzavřená plodnice s vytvořenou stěnou, otvírá se rozpadem; vřecka nejsou nijak uspořádána (např. teleomorfa rodu Aspergillus) - perithecium je kulovitá nebo protáhlá plodnice s úzkým ústím (ostiolem) vystlaným perifýzami, vřecka jsou uspořádána v hymeniu, mezi nimi se tvoří sterilní hyfová zakončení - parafýzy (např. Chaetomium) - apothecium je miskovitá plodnice; vřecka jsou uspořádána v hymeniu na povrchu plodnice, parafýzy vytvořeny 2) Askolokulární typ - askostroma - v pseudoparenchymatickém útvaru se diferencují pohlavní orgány, askogenní hyfy a vřecka vrůstají do sekundárně vytvořené lyzogenní dutiny (lokulu) Chaetomium globosum A - perithecium B - zvlněná nevětvená vlákna (trichomy) C - vřecko (ascus) D - askospory -34/36- Aspergillus nidulans - tvorba plodnic typu kleistothecium měchýřek Emericella nidulans, anamorfa Aspergillus nidulans fial idy metuly icon id fe askospory hůlle cells" Eurotium amstelodami anamorfa Aspergillus vitis vřecka konidie fialidy askospory a vrecko stopka — konidiofor -35/36- Použitá literatura: 1. Váňa, J.: Systém a vývoj hub a houbových organismů. Karolinum, Praha, 1996. 2. MycoBank, http://www.mycobank.org/ 3. De Hoog G.S.: et al.: Atlas of clinical fungi. Utrecht, Reus, 2000. 4. P.W. Crous, G.J.M. Verkley, J.Z. Groenewald, R.A. Samson. CBS Laboratory Manual Series 1, Fungal Biodiversity. CBS, Utrecht, 2009 5. https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/fi^^ 6. http://old.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/mikr.htm -36/36-