•Michaela Vorlíčková •Institute of Biophysics •Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i. Brno •Laboratory of CD spectroscopy of nucleic acids CD spektroskopie a konformační vlastnosti DNA U:\MIFI\obrazky\sbírka\kolostruktur.png C:\WINDOWS\Plocha\image002.jpg • •• Principles of circular dichroic (CD) spectroscopy •• Advantages and drawbacks of the use of CD spectroscopy to proteins and nucleic acids studies •• Characteristic CD spectra of particular nucleic acids types •• Structural properties of nucleic acids - fresh findings • • Cirkulární dichroismus a optická aktivita biopolymerů •) optická aktivita – chirální látky (aminokyseliny, cukry) úhel stočení roviny • polarizovaného světla, ORD •) CD – princip, veličiny, elipticita, ΔA, Δε, vztah mezi ORD a CD U:\MIFI\obrazky\sbírka\Macek-poekresl..jpg • Cirkulární dichroismus Δε Δε = εL – ε R = ΔA/lc, θ=3300. Δε • Elipticita φ [ψ] tg φ = b/a = εL – ε R/ εL + ε R Specific rotation [α]Tλ = α/cl V:\mifi-obr\nové obr pro CD presentaci\obrA.bmp V:\mifi-obr\nové obr pro CD presentaci\obrC.bmp •[α] •λ[nm] U:\MIFI\obrazky\sbírka\Macek-poekresl..jpg Cottonův efekt V:\mifi-obr\nové obr pro CD presentaci\obrF.bmp Cottonův efekt λ[nm] V:\mifi-obr\obr12.bmp •l •ORD • + •CD •ORD • - • •CD V:\mifi-obr\obr1.bmp •α- helix •β- sheet •β- turn CD of proteins Podmínky vzniku CD DNA • •ABSORBCE •CHIRALITA •+ •BÁZE •* CUKR •CD V:\mifi-obr\obr2.bmp Podmínky vzniku CD DNA • •ABSORBCE •CHIRALITA •+ •BÁZE •* CUKR •CD Cirkulární dichroismus a optická aktivita biopolymerů •) optická aktivita – chirální látky (aminokyseliny, cukry) úhel stočení roviny • polarizovaného světla, ORD •) CD – princip, veličiny, elipticita, ΔA, Δε, vztah mezi ORD a CD •) Výhody a nevýhody CD spektroskopie ve srovnání s jinými metodami • studia biopolymarů • •Výhody •Citlivost - nízká koncentrace studované látky • snadná rozpustnost • i v extrémních podmínkách •Snadná manipulace - titrace • přechody mezi různými strukturami • celý konformační prostor •Nevýhody •Pro složité molekly jakými je DNA chybí explicitní vztah mezi spektrem CD a strukturou •Rozlišení mezi kooperativními a nekooperativními změnami 40dichro 02fibryA 03fibryB 04fibryC •A •B •C,D,E,T 05BCA • •Tunis-Schneider, M.J.B. + Maestre, M.F. • •Kooperativní změny mezi diskrétními strukturami 06a •Příklady nekooperativních a kooperativních změn 06a • Nekooperativní změny • v rámci téže struktury Ivanov, V.I 05BCA • •Tunis-Schneider, M.J.B. + Maestre, M.F. • •Kooperativní změny mezi diskrétními strukturami 06a •Příklady nekooperativních a kooperativních změn 06a • Nekooperativní změny • v rámci téže struktury Ivanov, V.I. V:\Iva\učebnicováB.jpg U:\MIFI\obrazky\sbírka\ucebnicovaA.jpg •220 •300 •R •L •GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC l Pohl, F,. Jovin T.: J.Mol Biol 1972 06Olson Vilma Olson V:\mifi-obr\sejmout.jpg V:\mifi-obr\sejmout0005.jpg Sasisekharan, V. 09Z 08 •Z Dickerson, R. 11B 10B •B Dickerson, R. V:\mifi-obr\sejmout0001.jpg • •CD spectral changes accompanying B-Z transition of poly(dG-dC) V:\mifi-obr\ZDFB51-biol1_files\ZDFB51-biol1.jpg •B-form •Z-form • •wavelength [nm] V:\mifi-obr\obr7.bmp 12Ivanov V:\mifi-obr\BDJB49-biol1_files\BDJB49-biol1.jpg V:\mifi-obr\ZDFB51-biol1_files\ZDFB51-biol1.jpg V:\mifi-obr\ADH020-biol1.jpg 13BZ,BX •ATATATATATATATATATATATATATATATATATATA Vorlíčková, M., Sklenář, V., Kypr, J.: J. Mol. Biol. 166 (1983) 85-92 V:\mifi-obr\obr5.tif •X-DNA ATATATATATATATATATATATATATATATATATATA Vorlíčková, M., Sklenář, V., Kypr, J.: J. Mol. Biol. 166 (1983) 85-92 14zvyraz B B-A A A-X B-X X 41 LD LD = A - A Lineární dichroismus V:\mifi-obr\Fig2.jpg •ALTERNATING A-T FRAGMENT WITH HOOGSTEEN BASE PAIRING • •Subirana, J.: Proc.Nat.Acad.Sci.USA , 99, pp. 2806, 2002. • Biochemistry , 43, pp. 4092 - 4100, 2004. V:\mifi-obr\Fig1.jpg •G •C •G •C •G •C •C •G •C •G •C •G •… •… •A •T •A •T •A •T •T •A •T •A •T •A •… •… •A •C •A •C •A •C •T •G •T •G •T •G •… •… •(Pu)n . (Py)n complexes •Alternating (Pu-Py)n •B •A •Z •B •A •X •Z •B • •A • •Z •X •G •G •G •G •G •G •C •C •C •C •C •C •… •… •A •A •A •A •A •A •T •T •T •T •T •T •… •… •A •G •A •G •A •G •T •C •T •C •T •C •… •… •poly(dG).poly(dC) •poly(dA).poly(dT) • poly(dA-dG).poly(dC-dT) C:\WINDOWS\Plocha\149D-inset.jpg • DNA Triplex • • •Radhakrishnan, I., Patel, D.J. (1994) •Pyrimidine. Purine. Pyrimidine V:\mifi-obr\sejmout0004.jpg C:\WINDOWS\Plocha\135D-model.jpg •DNA TRIPLEX T C C T C C T T T T T T A G G A G G A T T T T T T G G T G G T •Radhakrishnan, I., Patel, D.J. (1993) •Pyrimidine. Purine. Purine V:\mifi-obr\sejmout0004.jpg •T Gray, D.M., Hung,S-H., Johnson, K.H.: •Methods Enzymol. 246 (1995) 19-34. •(GA)12 •(TC)12 C:\Documents and Settings\mifi\Plocha\Gray_30.jpg •The triplex formation determined by mixing curves U:\MIFI\presentace\Bez názvu 1.tif U:\MIFI\presentace\Bez názvu 2.tif U:\MIFI\presentace\Bez názvu 3.tif •Quadruplexes •Kang, C.H. et al.(1994) •frequently occur in promoters of genes and were shown to control their expression. • 27i-tetr • • • • • i - tetraplex •Two parallel-bonded duplexes are intercalated in the antiparallel fashion U:\MIFI\obrazky\sbírka\C.C+.jpg Leroy, J.L., Gueron, M.,1995 V:\mifi-obr\UDF043-inset.jpg V:\mifi-obr\UDF062-inset.jpg •CD spectra reflecting formation of a parallel and antiparallel • guanine quadruplex • • V:\mifi-obr\UD0014-inset.jpg RNA DNA DNA WAVELENGTH [nm] Fragment Pu-27 promotoru c-myc: TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG Pan, A.T. et al.: J.Am.Chem.Soc.126(2004)8710 V:\mifi-obr\G_Q_Elsevier.JPG V:\Iva\obr3.JPG V:\mifi-obr\Fig8.jpg V:\mifi-obr\Figure1.jpg V:\mifi-obr\Figure2.jpg V:\mifi-obr\Figure5.jpg Parkinson, G.N., Lee, M.P.H, Neidle, S. Nature 417 (2002) 876-880. d(TAGGGTTAGGGT) 12 d[AGGG(TTAGGG)3] 22 •Human telomeric DNA forms quadruplex • •Xu, Y.: Chem. Soc. Rev. (2011) C:\WINDOWS\Plocha\143D-model.jpg •The telomere quadruplex became a target for developing anticancer drugs Telomeric DNA is associated with aging •Vorlíčková, M.: Nucleic Acids Res. 33 (2005) 5851-5860.. •wavelength [nm] • G3(TTAG3)n in 150 mM K+ •1mM Na phsophate •Number of •G3 blocks •2 • 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 16 17 3+1 AG3(TTAG3)3 TAG3(TTAG3)3 AAAG3(TTAG3)3AA U:\Iva_U\2007\Mifi_Albany\3+1_lsam.jpg U:\Iva_U\2007\Mifi_Albany\3+1_sam.png TAG3(TTAG3)3TT •3 + 1 Luu, K.N., Phan, A.T., Kuryavyi, V., Lacroix, L., Patel, D.J. (2006) J.Am.Chem.Soc., 128, 9963-9970. Ambrus, A., Chen, D., Dai, J., Bialis, T., Jones, R.A., Yang, D. (2006) Nucleic Acids Res. 34, 2723–2735. Phan, A. T., Luu, K.N., Patel, D.J. (2006) Nucleic Acids Res., 34, 5715-5719. •anti • syn K+ 3 + 1 obr8 •Long telomere molecules have a beads on a string- like arrangement •Xu, et al. •Angev. Chemie (2009) •How does the structure of the long telomere DNA look like? • •Nucleic Acids Res. 33 (2005) 5851-5860 Vorlíčková, M. et al.: Nucleic Acids Res. 33 (2005) 5851-5860. 3-50 mM strand concentration in CD 3 + 1 AG3(TTAG3)3 TAG3(TTAG3)3 AAAG3(TTAG3)3AA U:\Iva_U\2007\Mifi_Albany\3+1_lsam.jpg U:\Iva_U\2007\Mifi_Albany\3+1_sam.png TAG3(TTAG3)3TT •3 + 1 U:\Iva_U\2007\Mifi_Albany\chair.jpg CHAIR AG3(TTAG3)3 BASKET Phan, at al.: Nucleic Acids Res. 34 (2006) 5715-5719. He et al.:Nucleic Acids Res. 32 (2004) 5359-5367. Matsugami, et al.:. Nucleic acids symp. series, 50 (2006) 45-46. Xu et al.: Bioorg.& Medicinal Chem. 14 (2006)5584 – 5591. Lim, et al.: J.Am.Chem.Soc. 131 (2009) 4301–4309. •anti •syn 0.2-5 mM strand concentration in NMR •BASKET •two tetrads •AG3(TTAG3 • G3(TTAG3)3 • AG3(TTAG3)3 •TTAG3(TTAG3)3 •G3(TTAG3) 3T •Luu, et al.: J.Am.Chem.Soc., 128 (2006) 9963-9970. •Ambrus, et al.: Nucleic Acids Res. 34 (2006) 2723–2735. •Parkinson, Lee, Neidle: •Nature 417 (2002) 876-880. •Balagurumoorthy, Brahmachari: J. Biol. Chem. 269 (1994) 21858-21869. •Redon et al.: Nucleic Acids Res. 31 (2003) 1605-1613. • K+ • PARALLEL Different quadruplex structures of human telomere DNA sequence were observed by various methods telomerni telomerni telomerni • telomerni telomerni telomerni • In nucleosides: • 200 mM • 120 mM • 55 mM • 16 mM • 0.8 mM •( 0.1 mM) • • G3(TTAG3)16 Renčiuk et al.: Nucleic Acids Research 37 (2009) 6625-6634 •CHIROPTICKÉ METODY • Optická rotační disperze-ORD •Závislost úhlu stočení roviny polarizace lineárně polarizovaného světla průchodem opticky aktivní látkou na vlnové délce procházejícího záření. (180-800 nm) •Cirkulární dichroismus-CD •Závislost rozdílu absorpce pro vlevo a vpravo kruhově polarizované světlo na vlnové délce absorbovaného záření v oblasti energií elektronových přechodů. (180-1000 nm) •Infračervený cirkulární dichroismus-IRCD (VCD) •Závislost rozdílu absorpce pro vlevo a vpravo kruhově polarizované světlo na vlnové délce absorbovaného záření v oblasti energií vibračních přechodů. (1-5 um) •Fluorescenčně detegovaný cirkulární dichroismus-FDCD •Závislost rozdílu intenzity fluorescence, excitované vlevo a vpravo kruhově polarizovaným světlem na vlnové délce excitačního záření. (~ 200 nm až vlnová délka emise) •Cirkulárně polarizovaná luminiscence (emise)-CPL (CPE) •Spektrální průběh rozdílu intenzit (spontánní) emise vlevo a vpravo cirkulárně polarizovaného světla. (Interval vlnových délek emise chromoforu) •Cirkulární diferenciální Ramanův rozptyl-Raman CID •Spektrální průběh rozdílů intenzit Ramanova rozptylu vlevo a vpravo kruhově polarizovaného dopadajícího záření. (Interval vlnových délek Ramanova jevu) • Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M.: Nucleic Acids Res. 37 (2009) 1713-1725. Jaroslav Kypr Iva Kejnovská Jana Chládková Petr Fojtík Daniel Renčiuk Klára Bednářová Martin Tomaško Petra Školáková Helena Kašparová Zuzana Dvořáková 01_umDNA Laboratory of the CD spectroscopy of Nucleic Acids