Enzymy používané v molekulární biologii Rozdělení enzymů 1.Podle substrátové specifity: většina metod molekulární biologie je závislá na použití enzymů, jejichž substrátem jsou nukleové kyseliny. Tyto reakce jsou velmi specifické a umožňují pracovat s velmi malým množstvím materiálu. Podle substrátové specifity se tyto enzymy dělí na dvě základní skupiny: –Enzymy, jejichž substrátem je DNA –Enzymy, jejichž substrátem je RNA •Substrátová specifita je obvykle absolutní, i když rozlišení mezi oběma druhy nukleových kyselin je podmíněno pouze přítomností nebo absencí 2´-OH skupiny ribosy. 2.Podle typu reakcí: –Enzymy syntetizující nukleové kyseliny (polymerázy) –Enzymy modifikující nukleové kyseliny (fosfatázy, metylázy, kinázy) –Enzymy spojující nukleotidové řetězce (ligázy) –Enzymy odbourávající nukleové kyseliny (nukleázy) •Podle substrátové specifity se enzymy jednotlivých skupin dále dělí, např. na DNA-polymerázy, RNA-polymerázy apod. – DNA-polymerázy •DNA-polymeráza I (E. coli): katalyzuje 3 odlišné reakce, jejich rychlost je ovlivněna stavem DNA a koncentrací dNTP v reakční směsi. Za vhodných podmínek degraduje polynukleotidový řetězec DNA ve směru 5´→3´ a současně degradovaný řetězec nahrazuje polymerační reakcí. Této vlastnosti se využívá ke značení DNA metodou tzv. posunu jednořetězcového zlomu („nick translation“). –Na dvouřetězcové DNA se vytvoří DNázou I náhodné jednořetězcové zlomy. Ty jsou substrátem pro působení DNA-polymerázy I. •Klenowův fragment DNA-pol I: jde o větší ze dvou fragmentů DNA-pol I, které vznikají při štěpení subtilizinem. Vykazuje 5´→3´ polymerázovou a 3´→5´ exonukleázovou aktivitu, oproti DNA-pol I postrádá 5´→3´ exonukleázovou aktivitu. Používá se při syntéze DNA, kdy nesmí docházet k odbourávání primerů, např. při enzymové metodě sekvencování, při značení DNA prodloužením primeru nebo při doplnění přečuhujících 5´-konců po restrikčním štěpení DNA. • • mapa114 mapa115 Polymerázy používané při PCR •Taq DNA-polymeráza (Thermus aquaticus): nejběžněji používaná polymeráza pro PCR, nemá korektorskou („proofreading“) aktivitu, následkem se při syntéze delších úseků hromadí chyby. Frekvence chyb je zhruba 1 na 4-5 tisíc bp. Špatně začleněná báze většinou vede k terminaci řetězce a současně i syntézy DNA. –Při použití PCR v molekulární diagnostice nejsou chybně začleněné báze problémem, protože vznik molekul DNA se stejnou chybou je málo pravděpodobný a molekuly s chybně inkorporovanou bází tvoří jen zlomek z celkového produktu. –Chybné začlenění bází však nabývá na důležitosti v případě klonování PCR produktů, neboť každý klon je odvozen z jediné molekuly DNA. Případná mutace vlivem špatné inkorporace báze způsobí, že tuto mutaci ponesou všechny molekuly DNA v potomstvu. Tyto mutace také mohou znamenat substituci aminokyselin při expresi prováděné in vitro. •Tyto problémy lze eliminovat buď použitím většího množství templátových molekul DNA při zahájení replikace. Pak je třeba méněcyklů a nasyntetizuje se méně DNA. •Nebo lze použít termostabilní DNA-polymerázu s 3´-exonukleázovou aktivitou. •Pwo DNA-polymeráza (Pyrococcus woesei) a Pfu DNA-polymeráza (Pyrococcus furiosus): frekvence chyb je 2-6 x nižší než u Taq DNA-polymerázy, což je způsobeno 3´-exonukleázovou aktivitou těchto enzymů. Na druhou stranu 3´-exonukleasová aktivita často způsobuje degradaci jednořetězcových primerů. Často se používají v kombinaci s Taq DNA-polymerázou pro amplifikaci dlouhých úseků DNA (stačí 1% Pwo nebo Pfu). •Tth DNA-polymeráza (Thermus thermophillus): je doporučována pro PCR dlouhých molekul DNA místo Taq DNA-polymerázy. • Zpětná (reverzní) transkriptáza (retroviry) •Patří do skupiny RNA-dependentních DNA-polymeráz. •Katalyzuje přepis genetické informace z RNA do DNA. •Využívá se k přípravě cDNA z mRNA. •Zpětné transkripty se využívají také k sekvencování RNA, jako sondy pro hybridizaci, případně jako templát při PCR. mapa119 mapa116 Terminální deoxyribonukleotidyltransferáza (telecí brzlík) •Katalyzuje připojování nukleotidů k 3´-koncům DNA. •Nevyžaduje templát, tím se liší od DNA-polymeráz. •Je využívána k připojování polydeoxyribonukleotidových úseků (tzv. homopolymerních konců) k fragmentům DNA a vektorovým molekulám s tupými konci. Tím se vytvářejí kohesivní (lepivé) navzájem komplementární konce. •Rovněž je využívána při koncovém značení nukleových kyselin. mapa128 DNA-ligáza •Katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi 5´-fosfátovou skupinou a 3´-OH skupinou sousedního nukleotidu. Používá se k vzájemnému spojení dvou molekul DNA zakončených komplementárními konci, k připojení spojek a adaptorů a cirkularizaci lineárních molekul DNA. •T4-DNA-ligáza (zdroj E. coli infikovaná bakteriofágem T4) dokáže na rozdíl od DNA-ligázy z E. coli spojovat i fragmenty s tupými konci. mapa129 Alkalická fosfatáza •Zdroje: telecí střevo, bakterie •Odstraňuje fosfátové skupiny z 5´-konců DNA, RNA a oligonukleotidů. •Využívá se při koncovém značení DNA, kdy se původní fosfátová skupina odstraní a její místo zaujme značená fosfátová skupina (32P, 35S). •Při klonování DNA se často odstraňují 5´-koncové skupiny u vektoru – zabraňuje se tím ligaci samotné vektorové molekuly bez inzertu, zvyšuje se účinnost klonování. T4-DNA-polynukleotidkináza •Zdroj: buňky E. coli infikované bakteriofágem T4 •Katalyzuje přenos terminální fosfátové skupiny z ATP na 5´-OH skupinu DNA nebo RNA. •Může katalyzovat i výměnu fosfátových skupin na 5´-konci. •Katalyzovaných reakcí se využívá ke značení fragmentů nukleových kyselin na 5´-koncích pomocí 32P. • mapa129 Uracil-DNA glykosylasa •Účastní se oprav poškozené DNA. Uracil v DNA vzniká deaminací cytosinu. •Uracil-DNA glykosylasa – katalyzuje uvolnění volného uracilu z DNA. Hydrolyzuje uracil z jedno- nebo dvouřetězcové DNA, ne z krátkých oligomerů (6 a méně nukleotidů). •Používá se preventivně v laboratořích k odstranění dříve amplifikované DNA: –Protože přenesené sekvence z dříve amplifikované DNA patří k nejvýznamnějším zdrojům kontaminace vzorků podrobených PCR, používá se v laboratořích rutinně provádějících PCR 2´-deoxyuridin-5´-trifosfát (dUTP) místo dTTP. –Před amplifikací dalších vzorků se do reakční směsi přidá uracil-DNA-glykosylasa (uracil-N-glykosylasa), která odstraní z případných kontaminant uracilové báze. Tím se v molekule DNA vytvoří abazická místa a DNA se stane termolabilní. Při první denaturaci dojde k rozštěpení DNA a zároveň denaturaci a inaktivaci uracil-DNA-glykosylasy. •Používá se spolu s dalšími reparačními enzymy ke studiu a detekci poškození DNA. mapa118 Cleavasa I •Specifická endonukleasa upravená metodami genového inženýrství. •Její cílové místo se nachází vždy u paty vlásenky vytvořené v molekule jednořetězcové DNA. •Používá se při diagnostické metodě CFLP (Polymorfizmus délky fragmentů DNA vytvořených cleavasou). •Touto metodou se detekují a lokalizují polymorfizmy v molekulách ssDNA připravených denaturací fragmentů koncově značené genomové DNA. •Optimální velikost těchto fragmentů je do 2700 bp. •ssDNA vytváří po rychlém ochlazení roztoku různé sekundární struktury v závislosti na své primární struktuře. •Cleavasa I nepůsobí na všechny vlásenky, dochází pouze k částečnému štěpení ssDNA. •Mutace a modifikace v nukleotidových sekvencích ovlivňují sekundární strukturu ssDNA. Konečným výsledkem je vytvoření rozdílných míst rozpoznávaných enzymem a vznik spektra fragmentů, které je charakteristické pro danou molekulu. •Jde vlastně o analogii s RFLP metodou. • mapa117 Jaké enzymy a prekurzory použiji pro značení DNA? •5‘-konec: radioaktivním fosfátem – polynukleotid kináza + g-32P-ATP (33P, 35S) • •3‘-konec: celým deoxynukleotidem (včetně a-fosfátu) a polymerázou –tedy a- 32P, 33P,35S dNTP (báze podle potřeby) –libovolný fluorofor, redox značka, biotin… vhodně připojený k cukru nebo bázi –primer extension (DNA polymerázy vč. Klenowova fragmentu) –výměna 3‘-koncových nukleotidů (proofreading exo+ polymerázy vč. Klenowa) –terminální deoxynukleotidyl transferázou (TdT) – jeden nebo několik nukleotidů náhodně bez templátu – •inkorporace značek dovnitř syntetizovaného řetězce –„nick translation“ (DNA polymerázy s 5‘→3‘ exo aktivitou; Pol I, Klenow+malý fragment – nikoli samotný Klenow!) –„random priming“ (DNA polymerázy vč. Klenowova fragmentu) –PCR (vhodné termostabilní DNA polymerázy) – – –