Růst a množení •Růst – mikrobiální buňka se nachází ve vhodném fyzikálně - chemickém prostředí, přijímá živiny a syntetizuje “sama sebe“, zvětšuje svoji hmotnost i objem •Množení – po dosažení daného objemu a hmotnosti se buňka rozdělí ve dvě dceřinné buňky •Při běžné komunikaci jsou tyto dva procesy spojovány pod jedním termínem – růst. • Růst a množení bakterií Růst a množení •Růst jednotlivé buňky – vyvážený – hmotnost, objem, obsah DNA, peptidoglykanu atd. roste za časovou jednotku rovnoměrně. Jestliže nejsou splněny podmínky jde o růst nevyvážený. •Růst populace – pokud jednotlivé buňky populace vykazují růst vyvážený, nachází se populace v ustáleném stavu (ve stavu dynamické rovnováhy) Další aspekty růstu •Růst nelimitovaný – všechny živiny jsou v nadbytku po celou dobu kultivace •Růst v tekutém prostředí (ve formě homogenní suspenze) nebo na/v zpevněném prostředí (ve formě kolonií) •Růst v přirozeném prostředí a v prostředí in vitro •Růst v prostředí homogenním (fermentor) a nehomogenním (půda, voda) •Růst v prostředí chemicky definovaném •Růst v otevřeném (kontinuální kultivace) a uzavřeném (zkumavka) •Růst čisté a směsné kultury • Buněčný cyklus u mikroorganizmů •Buněčný cyklus je základní biologický jev •Jde vlastně o ontogenetický vývoj buňky, který začíná vznikem buňky jako samostatné soustavy schopné existence a končící rozdělením této buňky opět na dvě existence schopné soustavy •Jedná se tedy v podstatě o historii buňky mezi dvěma po sobě následujícími děleními Buněčný cyklus u mikroorganizmů •Jestliže má dojít ke zdvojení buňky, musí tomu předcházet •zdvojnásobení všech nutných buněčných struktur •nahromadění potřebného množství energie •vytvoření dvou kopií genetické informace •aktivizaci mechanizmů, které vedou k rozdělení buňky Buněčný cyklus u mikroorganizmů •Celý cyklus představuje řadu procesů, fází, které následují za sebou •Jednotlivé kroky musí následovat v určitém pořadí, neboť jeden podmiňuje druhý - závislé posloupnosti (závislé sekvence) •Vztahy mezi jinými procesy nemusí mít přesnou časovou vazbu a pak jde o nezávislé posloupnosti (nezávislé sekvence - syntéza DNA a syntéza bílkovin Buněčný cyklus u mikroorganizmů •Pokud má dojít k rozdělení buňky , musí být realizovány všechny dílčí procesy - ukončení buněčného cyklu Buněčný cyklus u mikroorganizmů •Některé dílčí procesy buněčného cyklu vedou k nápadným změnám buňky. Na základě toho byl buněčný cyklus rozdělen na fáze buněčného cyklu Buněčný cyklus u mikroorganizmů •Ve fázích buněčného cyklu je řada procesů regulující jeho průběh - kontrolní uzly •Zde se ověřuje, zda byly dokončeny všechny reakce v závislých sekvencích a zda je buňka připravena na přechod do další fáze •Kontrolní uzel v G1-fázi startuje buněčný cyklus •Za určitých okolností může uvést buňku do tzv. G0-fáze • K ukončení buněčného cyklu a oddělení dvou dceřiných buněk slouží uzlový kontrolní bod na konci M-fáze. • Buněčný cyklus u mikroorganizmů •fáze G1 - počátek je vymezen skončením předchozí cytokineze a končí započetím replikace chromozomální DNA (vysoká fyziologická aktivita, velká frekvence transkripce, syntéza proteinů (strukturálních i s enzymatickou aktivitou). Během této fáze také dochází k případným opravám DNA. Přibližně 50 % celkové doby trvání buněčného cyklu. Buněčný cyklus u mikroorganizmů •fáze S (syntetická fáze) je dána dobou nutnou pro replikaci jaderné DNA. DNA se replikuje na dvojnásobné množství. Doba trvání asi 30 % doby cyklu •fáze G2 je zahájena skončením replikace DNA. Časová hranice mezi fázemi G2 a M je určována prvními morfologickými znaky dělení jádra. Představuje asi 15 % cyklu •fáze M - dělení jádra (mitóza, meióza) a cytokinezi. Tím končí buněčný cyklus vedoucí k rozdělení buňky. Počátek cytokineze nemusí být morfologicky zřetelný, konec je dán jednoznačně momentem, kdy obě dceřiné buňky jsou schopny samostatné existence (třebaže mohou zůstat spolu spojeny). Proto časové vymezení počátku fáze je dáno skončením dělení jádra a zaujímá cca 5 % doby cyklu. • Buněčný cyklus u bakterií •C fáze – zvětšování objemu buňky (Syntéza materiálu buňky včetně syntézy buněčné stěny –vkládáním stavebních jednotek na specifická místa). Začátek replikace bakteriálního chromozomu (na iniciaci se podílí produkt dnaA genu) •D fáze – dokončení replikace DNA, vytváření septa (přepážka tvořená cytoplazmatickou membránou a buněčnou stěnou). Dokončení rozdělení buňky ve dvě buňky dceřinné •Buněčný cyklus trvá od 20 do 60 minut •Doba trvání jednotlivých fází je téměř konstantní asi 41 min. – C, 20 min. – D •Takže v populaci s dobou zdvojení 20 min., musí se zdvojit všechny parametry (včetně DNA), tzn. že replikace DNA začne po 20 min. bez ohledu na to, zda předtím zahájené replikace skončily či nikoliv • • • • •C fáze •D fáze Buněčný cyklus u bakterií -Celý proces probíhá za přítomnosti řady enzymů a faktorů, které jsou lokalizovány do dvou replikačních uzlů. Replikace postupuje v obou směrech od počátečního místa (origin) k místu koncovému – terminus -Před skončením replikace DNA se začíná vytvářet Z kruh (počátek septa) za účasti FtsZ proteinu cytokinezinů a GTP - Terminace replikačního cyklu a rozchod chromozomů je nezbytným předpokladem pro vytvoření transverzálního septa (příčné přepážky). Tvorba přepážky (počátek cytokineze) je odlišná u G+ a G- bakterií Buněčný cyklus prokaryotické buňky Buněčný cyklus E. coli C:\Users\Uživatel\Desktop\NEMEC\Disk C\Dokumenty\Skripta fyziol\Podklady\Růst3.jpg •min •Mi - počáteční hmotnost buňky T – doba zvojnásobení hmotnosti buňky •ID – iniciace replikace DNA TD – terminace replikace DNA •TP – syntéza terminačního proteinu S – zahájení tvorby septa •Id – iniciace sekvencí vedoucích k dělení buňky •Is – iniciace sekvencí vedoucích k tvorbě septa •Td – dělení buňky (rozdělení buňky •1 – replikace DNA •2 – syntéza proteinů pro dělení buňky Replikace bakteriálního chromozomu •Připojení chromozomu na specifické místo – replikátor – na cytoplazmatické membráně (na mezozómu) •Začátek syntézy chromozomové DNA je oddělen od vlastní replikace. Iniciační komplex je vytvořen spojením proteinů DnaA se váží specifickou sekvencí DNA - počátek replikace (u E.coli oriC) •Vlastní replikace chromozomu od místa origin postupuje obousměrně. Rychlost inserce je 1700 nukleotidů za sekundu v replikační vidlici •Ukončení replikace je nutné pro vytvoření transverzálního septa Replikace bakteriálního chromozomu C:\Users\Uživatel\Desktop\NEMEC\Disk C\Dokumenty\Skripta fyziol\Podklady\Růst1.jpg •pomalý růst Buněčný cyklus je možné rozdělit do tří lineárních period •I – období mezi jednotlivými začátky replikace chromozomální DNA; považuje se také za dobu zdvojení •C - období replikace chromozomu •D – tvorba septa, dokončení rozdělení buňky •rychlý růst Replikace bakteriálního chromozomu •Pokud buňky rostou za “normálních“ podmínek počátek replikace chromozomu je dán parametry buňky (velikost, hmotnost,…) •Při růstu v suboptimálních podmínkách může docházet k překryvné replikaci, takže mateřská buňka může obsahovat chromozom prapravnučky Replikace bakteriálního chromozomu •Prostorové oddělení chromozomů •*u eukaryot – vřeténkem •*u prokaryot intenzivním lokálním růstem mezi místy připojení chromozomů k cytoplazmatické membráně • •střed růstové zóny •septum •počátek •terminus Replikace bakteriálního chromozomu •Jestliže je blokována replikace DNA, je ovlivněn celý buněčný cyklus • dojde k jeho přerušení Dělení buňky •Buněčná stěna •Tvořící se přepážka •DNA •Buněčná stěna •Cytoplazmatická membrána •DNA Dělení buňky syntéza peptidoglykanu •peptidoglykan se nesyntetizuje kontinuálně stejnou rychlostí v průběhu celého buněčného cyklu •do stávající peptidoglykanové vrstvy se nevkládají jednotlivé komponenty (NAM, DAP, peptidické řetězce) samostatně •Vkládání je v „blocích“ tzv. • „three-for-one růstový model“ Dělení buňky syntéza peptidoglykanu •V první fázi syntézy se vytváří „mureinový triplet - podle jednoho řetězce,primer, se po jeho obou stranách syntetizují nové řetězce •Mureinový triplet je potom kovalentně připojen k docking strand ze spodní strany k peptidoglykanové vrstvě •následuje vyjmutí dockovaný řetězec a vložení tripletu do stávající vrstvy •Výsledek - zvětšení peptidoglykanové vrstvy o dva glykozidické řetězce • Dělení buňky syntéza peptidoglykanu Dělení buňky - tvorba septa •Proces tvorby septa je zahájen invaginací cytoplazmatické membrány - začíná se vytvářet Z kruh (počátek septa) •Růst stěny, tvorba přepážky je umožněna působením enzymů hydrolyzujících vazby peptidoglykanu – autolyzinů •Tak vznikne prostor pro vložení nových stavebních částí do peptidoglykanu. •Peptidoglykan roste do délky s buňkou (G+) nebo dostředným růstem (G-) • • •Bez konstrikce u většiny G+ •S konstrikcí u většiny G- Tvorba septa u Escherichia coli • • •U G- se tvorby přepážky nezúčastňuje vnější membrána, takže materiál je v nadbytku a vytvářejí se mimobuněčné měchýřky •Poměr enzymů syntetizujících a hydrolyzujícícch peptidoglykan je striktně regulován.Vychýlení poměru by znamenalo zastavení růstu nebo autolýzu •Fyzické oddělení dceřinných buněk je uskutečňováno aktivitou autolyzinů •Po rozdělení mohou být některé buňky u některých druhů pasivně spojeny extracelulárním tmelem nebo společnou pochvou (streptokoky, stafylokoky, neiserie, bakterie vytvářející společnou pochvu, …) •OM •MP •CM •Mimobuněčné měchýřky •OM – vnější membrána •MP - peptidoglykan •CM – cytoplazmatická membrána Tvorba septa u B. subtilis •Min brání vytvoření septa na pólech •Z kruh •Kombinací proteinů Min a ON je vytvářen prostor pro lokalizaci Z kruhu Růst G+ buňky Dělení buněk •Vznik heterogenní populace •hod Dělení buněk •Buňky vzniklé dělením buňky rostoucí vyváženě, nejsou fyziologicky přesně identické a rovnocenné •V populaci se nacházejí buňky v odlišných fázích životního cyklu (od buněk nejmenších - těsně po rozdělení až po největší - těsně před rozdělením) •Jednotlivá buňka mezi děleními roste “rovnoměrně“ a její velikost je funkcí času • Růst populace v podmínkách in vitro •Statická kultivace – uzavřený systém – vysoká koncentrace živin na počátku, nízká na konci a vysoká koncentrace metabolitů na konci kultivace •Kontinuální – otevřený systém – koncentrace živin i metabolitů je udržována na stanovené hladině •Submerzní – většinou uzavřený systém, změny jsou obdobné jako u statické kultivace. Třepáním, provzdušňováním či mícháním se zvětšuje pravděpodobnost kolize živiny s povrchem buňky. Populace roste rychleji než “statická“ • • Množení mikroorganizmů v podmínkách statické kultivace - růstová křivka •I. Lag fáze •II. Fáze zrychleného růstu •III. Fáze logaritmická (exponenciální) •IV. Fáze zpomaleného růstu •V. Fáze stacionární •VI. Fáze poklesu •VII. Fáze zrychleného odumírání •Růstová křivka Růstová křivka •Lag fáze – buňky se většinou nemnoží, snižuje se počet životaschopných buněk.Buňky se přizpůsobují prostředí a syntetizují potřebné enzymy.Vytvářejí se látky potřebné pro rozdělení buňky. •Fáze zrychleného růstu (fáze fyziologického mládí) – buňky jsou přizpůsobeny prostředí, ke konci rychle metabolizují a dělí se. V této fázi jsou velmi citlivé k nepříznivým faktorům. •Fáze logaritmická (exponenciální) – intenzivní růst, počet buněk narůstá geometrickou řadou, malý počet odumírajících buněk. Rychlé využívání substrátů a velká tvorba metabolitů • • • Růstová křivka •Fáze zpomaleného růstu – postupné zpomalování růstu a metabolizmu. Zvyšuje se počet odumírajících buněk v důsledku snížení koncentrace živin a zvyšování koncentrace metabolitů (většinou toxické povahy). •Fáze stacionární – počet odumírajících a vznikajících buněk se vyrovnává (nulová růstová rychlost). Počet buněk dosahuje maxima (M-koncentrace). Zvýšená produkce látek sekundárního metabolizmu. •Fáze poklesu a fáze zrychleného odumírání – narůstající úbytek buněk, rychlost dělení nabývá negativních hodnot. Snížení koncentrace živin pod limitní hodnotu. Postupné odbourávání zásobních látek. • • Růstové konstanty •Stanoví se na základě hodnot získaných v exponenciální fázi růstové křivky •Základním zákonem růstu a množení prokaryotické populace je geometrická řada s kvocientem 2 • C:\Users\Uživatel\Desktop\NEMEC\Disk C\Dokumenty\Skripta fyziol\Podklady\Růst4.jpg Růstové konstanty •Počet buněk v původní populaci je • x0 •Počet buněk po prvním dělení (1. generace) • x1 = 2x0 •Počet buněk po druhém dělení (2. generace) • x2 = 2.2.x0 •Počet buněk po třetím dělení (3. generace) • x3 = 2.22.x0 •Počet buněk po n-tém dělení (n generace) • xn = 2n . X0 • •V čase t potom • t = nT, kde •n – počet zdvojení za dobu t-t0, T doba potřebná k rozdělení buňky • • • Růstové konstanty •Dosadíme-li za n = t/T do rovnice • xn = 2n . x0 •Bude se počet buněk v závislosti na čase rovnat x = x021/T •Počet generací n v čase lze vypočíst i použitím dekadických logaritmů • log x = log x0 + n log 2 Růstové konstanty •Jestliže se vztáhne n na dobu, po kterou populace rostla - průměrná rychlost dělení (R) • • • •Z tohoto vztahu se odvodí střední generační doba ( ) • • Růstové konstanty •V exponenciální fázi platí, že rychlost růstu mikrobiální populace je v kterémkoliv okamžiku této fáze úměrná počtu buněk • • •Kde μ je konstanta, tzn. růstová rychlost přepočtená na jednu buňku nebo biomasu a označuje se jako specifická růstová rychlost Růstové konstanty •Hodnota μ je v exponenciální fázi závislá na koncentraci substrátu (esenciální živiny) • • • •kde • μm = maximální růstová rychlost • S = koncentrace substrátu • KS = saturační konstanta (zde je číselně rovna koncentraci substrátu, při níž μ odpovídá poloviční hodnotě μm . Skutečné hodnoty jsou velmi nízké a většiny substrátů se pohybují v rozmezí jednotek mg/l. • Závislost μ na koncentraci živiny •KS je velmi malá (asi o dva řády menší než běžně používané koncentrace v mediích), takže hodnota μ je při běžné kultivaci prakticky stejná •Rychlost růstu v exponenciální fázi bude konstantní v širokém spektru koncentrací dané živiny. A měnit se bude teprve po významném poklesu její koncentrace •L = tk - te •tk - doba trvání experimentu (experimentálně zjištěná) Růstové konstanty stanovení doby „lagu“ Diauxie •Tento způsob růstu je typický pro prostředí se dvěma odlišnými zdroji uhlíku a energie v tekutém prostředí •Nejprve je využíván jeden, přičemž enzymy pro využívání druhého jsou blokovány •Po vyčerpání 1. substrátu nastupuje využívání druhého •Růst populace je charakterizován dvěma lag fázemi a dvěma log fázemi •Pořadí využívání substrátů je regulováno Mnohonásobná logaritmická fáze •Způsob růstu populace, při němž na sebe navazuje několik log fází •Tyto fáze se od sebe liší rozdílnou růstovou rychlostí •Je to odraz změn prostředí, ke kterým dochází v průběhu kultivace (např. vyčerpáním jedné živiny a využíváním jiné). Možné je také hromadění metabolitů, které později vystupují jako sekundární substrát •Jako regulační faktor může vystupovat i CO2. Při suboptimální koncentraci jsou syntetizovány zásobní látky, které jsou následně využívány po vyčerpání základního media • Syntéza enzymů v průběhu růstu Metody pro stanovení růstové křivky •Počítáním živých buněk (plotnová metoda, počítací komůrka) •Stanovením optické denzity suspenze •Stanovením biomasy Metody pro stanovení růstové křivky •Počítáním živých buněk - plotnová metoda •10-2 •10-3 •10-4 •10-5 •10-6 •10-7 Metody pro stanovení růstové křivky •Počítáním živých buněk – metoda membránových filtrů •nálevka •membránový filtr •základní deska •Miska s agarem • •vakuum Metody pro stanovení růstové křivky •Počítáním živých buněk – počítací komůrka • Metody pro stanovení růstové křivky •Stanovením optické denzity suspenze •OD (%) •čas •Růstová křivka stanovená turbidimetrem Metody pro stanovení růstové křivky •Stanovením biomasy • *stanovení sušiny • *rozpustných bílkovin • *mokré biomasy • *DNA • Synchronizace dělení •Při kultivaci za “normálních“ podmínek je mikrobiální populace fyziologicky heterogenní. Důsledkem je, že v populaci se nacházejí buňky v různém stádiu životního cyklu. •Proto hodnota generační doby vypočtená podle vztahu • • • • je průměrnou hodnotou pro populaci •K získání fyziologicky homogenní populace se používá metody synchronizace, navozující stav, kdy populace se chová “jako“ individuální buňka Synchronizace dělení •Metody navození synchronního množení •*chladový šok – zastavení buněčného cyklu ve fázi G1- blokována syntéza DNA •*zfázování hladověním – využití výživového signálu (ve fázi G1) •*filtrace membránovými filtry (zachycení buněk o přibližně stejné velikosti) Synchronizace dělení Podmínky pro submerzní kultivaci Růst a množení v podmínkách kontinuální kultivace •Základem kontinuální kultivace je eliminace vlivu limitujícího faktoru na růst populace •Do kultivační nádoby je neustále přiváděno čerstvé médium a odváděno přebytečné včetně buněk •Tím se vytvoří stav dynamické rovnováhy a buňky jsou v ustáleném fyziologickém stavu. V tomto stavu by bylo možné udržovat rostoucí populaci téměř neomezenou dobu •Kontinuální kultivace je systém otevřený Růst a množení v podmínkách kontinuální kultivace •Turbidostat – všechny živiny jsou v nadbytku. Růst je regulován rychlostí přítoku živného média •Chemostat – živné médium přitéká konstantní rychlostí. Růst je regulován koncentrací esenciální živiny • Zařízení pro kontinuální kultivaci turbidostat Růst a množení v podmínkách kontinuální kultivace - turbidostat •Při kontinuální kultivaci buněk přibývá podle rovnice • • •Buněk ubývá podle vztahu • • •Kde x – koncentrace buněk, V – objem kultury (l), w – rychlost přítoku media (l/h) •(g.l-1.h-1) •(g.l-1.h-1) Růst a množení v podmínkách kontinuální kultivace - turbidostat •Zřeďovací rychlost (D) je dána vztahem • • •Doba zdržení – je reciproká hodnota D • • • a udává průměrnou dobu, po kterou se partikule v systému udrží •Jestliže μ>D buněk bude přibývat • μ