doc. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D. Buněčné systémy ve vývoji: Wnt signální dráha a kmenové buňky Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka Transkripční faktory Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka Wnt (Wingless/Int) - rodina ligandů - 19 genů pro proteiny Wnt u člověka a u myši - extracelulární proteiny modifikované glykosylací a palmitoylací - působí na krátké vzdálenosti, váží se k extracelulární matrix - pouze u mnohobuněčných živočichů kanonická dráha /závislá na β-kateninu/ (např. Wnt-1 or Wnt-3a) nekanonická dráha /na β-kateninu nezávislá/ (např. Wnt-5a) Wnt/β-kateninová dráha (= kanonická dráha) - indukuje duplikaci tělní osy u Xenopus - indukuje transformaci buněčné linie odvozené od lidských prsních epiteliálních buněk C57mg - signál přenášen přes translokaci b-kateninu do jádra - 29836_1_two_mind_tadpole_BIL110809 Sekrece Wnt Kanonická signální dráha Wnt Kanonická signální dráha Wnt - legenda k obrázku: Frizzled – klíčový receptor většiny (všech?) signálních drah Wnt Lrp5/6 – stěžejní ko-receptor kanonické signální dráhy Wnt destruction complex Destrukční komplex destruction complex destruction complex destruction complex destruction complex destruction complex Destrukční komplex A working model for the destruction complex. (1) Initially, the destruction complex contains Axin, GSK3, CK1 and APC (with the 15 aa and 20 aa repeat regions shown). The complex contains other components such as PP2A, which are not shown here. (2) -Catenin enters the complex by binding Axin and potentially the APC 15 aa repeats. This positions the N-terminus of -catenin near CK1 and GSK3. (3) CK1 phosphorylates -catenin at Ser45. (4) GSK3 phosphorylates -catenin at, successively, Thr41, Ser37 and Ser33. (5) The 20 aa repeats, particularly repeat 3, are phosphorylated by a CK1 (and possibly GSK3) which greatly increases their affinity for -catenin. The binding of a phosphorylated 20 aa repeat to -catenin displaces Axin from -catenin. (6) -TRCP1 binds the phosphorylated N-terminus of -catenin, causing the ubiquitination of -catenin by an E2 ligase. APC is then either desphosphorylated within the complex, allowing the ubiquitinated -catenin to leave the complex, or the ubiquitinated -catenin bound to APC leaves the complex and is separated from APC at the proteasome. The complex then returns to Step 1 - legenda k obrázku destrukčního komplexu: Kanonická signální Wnt dráha - video Beta-catenin se v buňkách vyskytuje ve dvou hlavních „poolech“ – biochemických komplexech 9_wnt Tyr142 na b-kateninu: fosforylován: váže Bcl9 bez fosforylace: váže a-katenin Epithelio-mesenchymální transice a role β-kateninu v tomto procesu Výsledek obrázku pro epithelial mesenchymal transformation Epiteliálně-mezenchymální tranzice (EMT) v nádorech Příklady vývojových procesů regulovaných kanonickou Wnt dráhou Příklady vývojových procesů regulovaných kanonickou Wnt dráhou Maternální Wnt/b-kateninová dráha determinuje dorsální (horní) pól vyvíjející se zygoty a embrya Maternální Wnt/β-cateninová dráha determinuje dorsální (horní) pól vyvíjející se zygoty a embrya xenopus_gastrulation_2 xenopus_gastrulation_2 maternal Wnt in Xenopus Maternální Wnt/β-cateninová dráha determinuje dorsální (horní) pól vyvíjející se zygoty a embrya frogs maternal Wnt in Xenopus Maternální Wnt/β-cateninová dráha determinuje dorsální (horní) pól vyvíjející se zygoty a embrya Wnt/b-cateninová dráha určuje anterioro-posteriorní (AP, předo-zadní) osu těla během gastrulace – podporuje vznik zadních a blokuje vznik předních částí těla Maternální Wnt/β-cateninová dráha determinuje dorsální (horní) pól vyvíjející se zygoty a embrya Uncx4 myší embryo po gastrulaci (E8.5): Cílové geny Wnt/b-cateninové dráhy jsou exprimovány v zadní části těla. Deplece Wnt/β-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta zadních částí těla wild type Wnt-3a knockout Deplece inhibitorů Wnt/b-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta předních částí těla wild type vs. Dkk1 knockout Příklady vývojových procesů regulovaných kanonickou Wnt dráhou Wnt/β-cateninová dráha reguluje vývoj neurální lišty (neural crest) Nervová lišta (neural crest) -populace buněk, vzniká z dorsální (= horní) strany nervové trubice procesem delaminace a migruje několika hlavními cestami do jiných částí embrya neural crest Co všechno z NC vzniká? - podíl na vzniku cca 40 různých tkání a orgánů Oblast trupu: co z ní vzniká 2 • Neurony a gliální buňky senzorického, sympatického a parasympatického systému • Buňky dřeně nadledvin • Pigmentové buňky epidermis • Svalové buňky některých cév Vývoj neurální lišty: - neurální lišta je zdrojem periferního nervového systému, melanocytů, obličejových kostí a svalů, částí srdce a dalších Wnt3a in NC Wnt-3a Co všechno z NC vzniká? buňky NL kuřecí lebka buňky NL člověk Wnt signalizace při vývoji neurální lišty Hari, L. et al. J. Cell Biol. 2002;159:867-880 Nekanonická Wnt dráha - indukovaná např. ligandem Wnt5a frogs-gastrulation - neindukuje duplikaci tělní osy u Xenopus - neindukuje transformaci buněčné linie odvozené od lidských prsních epiteliálních buněk C57mg - signál NENÍ přenášen přes translokaci b-kateninu do jádra - Wnts (Wingless/Int) Drosophila – planární buněčná polarita (planar cell polarity, PCP) PCP scheme drosophila wing Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 - legenda k obrázku: Poruchy v nekanonické signální dráze Wnt u savců Poruchy v nekanonické signální dráze Wnt u savců Nekanonická dráha/dráha PCP: fenotypy u myši Orientace stereocilií vláskových buněk ve vnitřním uchu Actin Qian et al., 2007, Dev. Biol. inner_ear_hair_cells ear%20cutout Nekanonická dráha/dráha PCP při konvergentní extenzi u myši (a člověka) Konvergentní extenze – migrace buněk směrem ke středu těla – vede k prodlužování tělní osy Konvergentní extenze - video Důsledky narušené konvergentní extenze (CE) Důsledky narušené konvergentní extenze (CE) exencephaly Exencefalie: Hamblet et al., 2002, Development Otevřená nervová trubice: Možnosti studia migrace – polarizace a migrace: Transwell assays (savčí buňky) transwell chamber transwell corning Atraktant Možnosti studia migrace a polarizace – attractant/repelent assays Attractant / repelent Wnt repulsion Wnt Repulsion 2 * Pro zájemce o tuto problematiku: • Kmenové buňky Dr. Jiří Pacherník: Bi7575 Fyziologie kmenových buněk Kmenové buňky •tkáňově specifické •embryonální kmenové (ES) a) sebeobnova (selfrenewal) b) multipotence – schopnost dávat vznik dalším buněčným typům blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Příprava myších embryonálních kmenových buněk: den 0 (2.5% trypsin) den 6 den 7 vymytí blastocysty ~den 11 ~den 17 (další cykly trypsinizace) ~den 12 zamražení (0.25% trypsin) parkin1 d5 fcs 20x kopie Parkin-D2-FCS1-20x kopie parkin 3c sr 20x parkin 3a sr 20x parkin3 d5 sr20x parkin3 D2 sr20x žádné kolonie připomínající ES buňky chimaera-picture Využití myších ES buněk pro transgenezi mouse transgenesis •Nobelova cena 2007 •Mario R. Capecchi, Martin J. Evans and Oliver Smithies •za •„principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells“ Využití myších ES buněk pro transgenezi Science. 1998 Nov 6;282(5391):1145-7 blastocysta dospělá tkáň In vivo ES differentiation In vitro vyvíjející se tkáň (orgán) Kde jsou, jak vypadají a co kontroluje tkáňové kmenové buňky? Uslyšíte příště 8h embryo ICM 2d embryo circulation Indukované kmenové buňky - iPSCs Oct3/4 Sox2 c-Myc Klf4 Indukované kmenové buňky - iPSCs Pravoúhlý trojúhelník: ontogeneze ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Kmenové buňky K čemu jsou, jak vypadají a jak jsou regulovány kmenové buňky v dospělém organismu? K čemu jsou tkáňově specifické kmenové buňky? 1) K zajištění homeostázy •v lidském organismu běžně regenerují celé tkáně – např. vlasové kořínky (doba „života“ 3-4 roky), epitel střeva, epitel plic, krevní buňky nebo játra • 2) K zajištění procesu hojení a regenerace • Y:\Dokumenty\2017\Prednaska\Cell Biology in numbers\27.tiff Časy – délka „života“ buněk Využití přechodného zvýšení 14C z dob studené války (Jonas Frisén, Karolinska) Nervové buňky mozkové kůry •Jak zjistit délku „života“ buněk/intenzitu obnovy tkání? Regenerace srdce: salamander regeneration Schopnosti regenerace se liší mezi jednotlivými organismy salamander regeneration hand po amputaci: hand po 10 letech: Schopnosti regenerace se liší mezi jednotlivými organismy Morfogenetické sign. dráhy (kanonická Wnt signalizace, Hedgehog, TGF, Notch) jsou nezbytné pro regeraci u řady mnohobuněčných organismů chick axolotl Morfogenetické sign. dráhy (kanonická Wnt signalizace, Hedgehog, TGF, Notch) jsou nezbytné pro regeraci u řady mnohobuněčných organismů Wnts in fin regeneration zebrafish Wnts in fin regeneration II ... Regenerace pod kontrolou Wnt signální dráhy u ploštěnky