Osteopreparační techniky Laboratoř morfologie a forenzní antropologie FAKULTNÍ NEMOCNICE U SV. ANNY V BRNĚ očištěni odkrvení kostrování (macerace) odmaštění bělení konečná úprava Komparace maceračních technik x Hnilobné bakterie x Kožojedi Vroucí voda x Vodný roztok sody 5 % x Vodný roztok 1 % KOH x Vodný roztok 0,5 % NaOH Vodný roztok Persilu 35g/5 1 Vodný roztok Albinizér / Bělotrofixu 30-40g/l Vodný roztok trypsinu 1 % Vodný roztok amoniaku 1:1 Hrubé očistení t TT r r\r ttt Macerace 1 Macerace 2 aerace 4 Macerace 5 Macerace 6 Macerace 7 TÄTCtrnctrr^ \ Macerace 8 Macerace 10 Macerace 11 t a Tr-r^v rf ^t t Odmaštění odstranění svalstva (macerace ve vodě) > odkrvení ve studené vodě > macerace ve vodě (při teplotě 30°C bez kovu) > praní ve vodě a sušení > odmaštění (tetrachlór, trichlorethylen, benzín - větší kosti navrtat) > bělení 5 - max. 10 % H202 alkalizovaným NaOH nebo amoniakem vyprání tekoucí vodou a sušení Prep arace varem odstranění svalstva > odkrvení 1% vodném roztoku NaCl (24-48 hodin) - studenou vodu měnit > vaříme (hodiny) a kontrolujeme se žabkou nebo 0,5% NaOH > vysušíme a bělíme 5 - max. 10% H202 na tmavém místě 24 hodin > tvrzení namočením do laku, nebo namočením do voda:lepidlo 1:1 přilepení zubů, slepení a úprava chybějících částí Chemická hydrolýza bílkovin odstranění svaloviny > odkrvení v 1% KOH při teplotě 20°C 1-5 dní > vaření v 1 % KOH (NaOH) při teplotě 60 °C, oplach vodou > proprat a sušit > odmaštění v krystalické sodě nebo jiném změkčovadle > bělení do barvy slonové kosti 5-10% H202 alkalizovaným 5ml 25 % amoniaku na llitr nebo 5ml NaOH na llitr destilované vody > NELZE PROVÁDĚT PO PŘEDCHOZÍ FIXACI FORMOLEM!!!!(!) Macerace amoniakem TTT jeho silná koncentrace hydrolyzuje svalovou tkán a reaguje s tukem 24h máčení kostí v konc. hydroxidu amonném a následně var 1-4 hodiny 1:1 s vodou > svaly zrosolovatí a odpreparují se a opláchnou > ŠTIPLAVÝ ZÁPACH A MOŽNOST POŠKOZENÍ KOSTÍ!!!! (2) U 1fl7 Preparace antiforminem 1 r- f~- CfTT rTTAT antiformin (sodium hypochlorate), rychle hydrolyzuje měkké tkáně > dle Harrise (1959) smícháme roztok 150g sody v 250 ml vody se 100 g chloridu vápenatého v 750 ml vody a mícháme 2-4 hodiny, roztok filtrujeme a přidáme stejné množství 15 % NaOH, konc. roztok antiforminu ředíme na 10 % destilovanou nebo měkkou vodou > dle Kaewela (1928) používáme 5-10 % roztok ze surového antiforminu při teplotě 50-60 °C vkládáme skelet očištěný od měkkých tkání a necháme jej vložený v roztoku 6-12 hodin, oplach horkou vodou a sušení, použití například pro zachování meziobratlových plotének -párou ohřátý preparát) > antiforminový koncentrovaný roztok se skladuje v temnu a chladu (2, 4) Preparace pepsinem je to proteináza, trávící enzym ze žaludeční sliznice, urychluje 1. st. trávení proteinů, jejich štěpení na nižší složky za přítomnosti HC1 > jedná se o jemný bílý málo hygroskopický prášek > používá se stejně jako trypsin při odbourávání proteinů při teplotě 40 °c, > pH 1,5 - 2,5 s pomocí HC1, při teplotě 50-60 °C je již neúčinný > SILNÝ ZÁPACH!!!!! (2) Preparace papainem jedná se o proteolytický enzym s účinky jako pepsin, získává se ze sušeného latexu plodů papaje > dle Luthera (1949): odstranění kůže ze zvířete (např. myši) a vyvrhnutí > vaření 10 minut, ochladit na 37°C a vložení objektu do 35°C fyz. roztoku s 1% papainovým práškem přes noc, odstranění vazů a kostí-nesoudržnost > ZÁPACH!!!!! (3) Preparace jemných objektů (malý plod) biologická macerace > macerace v 25-45 % etanolu > odpreparování měkkých tkání > lze použít N202 3-4 g a 100 ml destilované vody odstranění zrosolovatělého svalstva (1) Preparace chrupavčitých koster macerace 30 % etanolem (trypsinem etc.) a odpreparování > CHRUPAVKY NESMÍ ZASCHNOUT!!!!!! > vyprání ve vodě, odmaštění > převedení vzestupnou alkoholovou řadou 30, 50, 70, 96% až do benzinu > převedení sestupnou alkoholovou řadou do vody > bělení 10 % H202 a 2 % KOH trvalé uložení v 70 % etanolu pomocí vzestupné alkoholové řady (1) Preparace trypsinem (chrupavky, embryonální kostry) enzym z pankreatu - rozpouští lipidy a proteiny > účinný ve slabě alkalickém prostředí > dle Rowleye (1925) přidáme na 4 litry 35-40 °C vody 2 plné čajové lžíce trypsinu a 1 čajová lžíce sirníku sodného, důkladně ve vodě macerované kosti, výměna vody 2-3dny, sbírání pěny, amoniak + var 2-3 hodiny > modifikace Rowleyovi tekutiny: lg NH2S+lg trypsinu a 100 ml fyz. roztoku; koncentrace solného roztoku pro savce 0,9 %, ptáky a plazy 0,75 % a obojživelníky 0,65 % 30 min. v 60 - 70 °C destilované vodě, odpreparování nebo: 50 ml 0,3 % roztoku K2C03 a špičku nože trypsinu nebo chloroformu ^^^H maceraci zastavíme vložením do roztoku formolu SILNÝ ZÁPACH!!!! (2) r r Další metody kostrování pomocí brouku kožojedu v tzv. dermestáriu > jsou známy i pokusy pomocí moučných červů, šatních molů, švábů atd... > pomocí vodních zvířat (raka skořepatce, pulců, sviněk, cirolany harfordi, říčních raků....) Metody odmašťování chemicky studenou cestou ❖ chemicky teplou cestou > polyetylenglykol - odstranění krve i tuku s katalyzátorem a emulgátorem > dle Klugeho (1973) lze použít prací prostředky používaly a používají se různé aparáty (benzín, tetrachlór, petrolbenzín, diethyléther, benzín+éter, chlorid uhličitý.....) -TEKAVÉ PARY > sirovodík - snadno hořlavý, vypařuje se již při pokojové teplotě, do nádoby se vloží kosti, nalije se sirovodík a přelije se vodou, odtučnění za 2-3 týdny > xylol 5 - 10 % rozpouští tuky a mastné kyseliny při 60 °C za 12-24 hodin, proprat ve vodě (2) Metody bělení vytáhnout z alveolu nebo se před bělením zakapou parafínem či voskem, popřípadě se natřou lakem či lepidlem a po bělení se tato látka odstraní (horkou vodou, acetonem atd...) > uchováváme jej v temnu a chladnu > bělíme v temnu 5 - 10 % peroxidem vodíku, oplach a sušení > lze bělit H202 i za zvýšené teploty - odbourávání se urychlí (300ml na 51 vody) > bělíme v nekovových nádobách (oxidace) dřevěných, smaltových, plast... > bělení pomocí chlorového vápna ldíl vápna + 4 díly vody a přecedit > bělení pomocí Javelského louhu (vodný roztok chlornanu draselného): smícháme ldíl vápna + 12dílů vody s 1 dílem potaše a 4 díly vody, slít a vzniklý roztok ředíme 1:1 s vodou (2) Sestavování koster ^OPrfTAOA5TTTT KOPTCT dříve se používaly drátky a pružinky > dnes i lepené spoje popřípadě silonové nitě kostry např. novorozenců s vazivovými spoji se uchovávají ve fixační tekutině nebo se vysuší v určit poloze DIFERENCIAČNÍ BARVENÍ KOSTNÍ TKÁNĚ S PROJASNĚNÍM PREPARÁTU. Použitá metoda : Hood,R.C.W.S. a Neil,W.M. A modiPication of alizarin red "S" technique Por demonstrating bone farmation. Stain Technol.,23,1948: 209-218. Pracovní postup: 1) Materiál ponoríme na tři dny do 95% alkohol i 2) Dále převedeme materiál na tri dny do 2% KOH. 3) 6-12 hodin barvíme vzorek 0,01% alizarinem. 4> Takto zpracovaný vzorek kostní tkaná ponoříme na jeden den do 2.7. KOH. Dále uchováváme materiál v termostatu při stálé teplotě 35JC v následujících roztocích: Roztok c.I - Roztok č I dil 27. KOH I díl 0,2'/. -Formaldehyd I díl glycerin I d íl 27. KOH 4 díly glycerin 2 dn i o ei Takto zpracovaný materiál přeneseme do teplého glycerinu, kde se preparáty vyčistí. Preparáty trvale uchováváme v glycerinu s přídavkem zrnka thymolu. Dekalcifikace rozpuštění minerálních solí zředěnými kyselinami > dostatečná fixáž > po fixáži praní ve vodě nebo etanolu > rychlost - množstvím, denní výměnou a teplotou 37 °C > odstranění v soli (5 % síran sodný, lithný, draselný) > zásadně neprat ihned po dekacifikaci vodou ❖ stupen dekalcifikace lze zjistit vbodnutím preparační jehly, nebo chemicky ❖ dekalcifikační tekutiny: Chelaton III, kyselina mravenčí, dusičná, Krutsay... ❖ Chelaton III: 1-3 týdny, 250g do 1000 ml vody, úprava pH 7,5 pomocí KOH(l) Zpracování neodvápněné tkáně zalití do metylmetakrylátu, řezaní mikrotomem K Jung Leica, fixace pufrovaným formolem ❖ výbrusy: tenké ploténky ze zubu či kosti > zalití do metylmetakrylátu, broušení pomocí brusných past a zalití do kanadského balzámu (1) Uchování exhumovaných kostí exhumované kosti se na vzduchu rozpadají, proto se musí konzervovat; nátěrem roztoku celoidinového filmu a napuštěním vysušených kostí x dle Fettera > 50 g kousků rozpustit ve 250 ml acetonu s 250 g octanu amylnatého ke konzervaci se použije roztok ředěný 1:5 ředidlem, složeno ze stejných dílů acetonu a amylacetátu (1) príprava lebky k odlévání natřeme model šelakem > rozdělení na dvě poloviny na několika místech připevnit malé kužely -vzdušníky > nanesení sádry na Vi modelu navrtání zámků > styčné plochy pláště natřít šelakem a olejem zhotovení sádrového pláště druhé Vi modelu Obr. 2. Šipkou označené výčnelky Ivofi .zámek' sádrového pláStě pro telattno vou formu /kadlub! Obr. 3. a 4. Pfíprava modelu ke zhotoveni styčné plochy sádry potřít šelakem > sejmutý díl pláště potřít šelakem a olejem > nalívat teplou želatinu mezi model a sádru > ucpat otvory a nechat schnout > stejně zhotovíme druhou Vi modelu > sejmout sádrový plášť a potřít šelakem > potřít styčné plochy želatiny a sádry kamencem a sterinem > přiložit plášť a odlít druhou Vi modelu želatínové formy > želatínovou plochu posypat klouzkem a potřít kamencem Obr. 5. Horní polovina sádrového pláště; otvor, Jímž se želatina vlévá do prostoru mezi modelem a sádrovém $ů!ttém (č. II. vzdušník (č. 2) Zhotovení pozitivu modelu vnitřní plochy formy potřít olejem > do Vi poloviny formy nalít sádru, přiklopit druhou > zasadit díly formy do sebe > otáčet formou poloviny formy oddělit od sebe Náhrada lícní kosti T Á r ' OCT TT/^TTT TSTl^n Ukázka úpravy kosti po odběru biologického materiálu POUŽITÁ LITERATURA . , w r-i i vi oi7W (1) Kolčava, Josef, Naděžda Fojtů a Jiří Merlíček. Základy preparačních technik. Brno: Mikadapress, 2004. ISBN 80-7013-403-8. (2) Piechocki, Rudolf. Herstellung von Skelletpraparaten. Makroskopische Praparationstechnik. Liebzig: Akademische Verlags Gesselschaft, 1986. s 202- 220. (3) Luther, P. G. Enzymatic maceration of skeletons. Proc. Linn. Soc. London: 1949. 61:146-147. (4) Kaewel, R. Maceration von Knochenpraparaten mizels Antiformin. Zbl.Path.1928. 41: 385-388.