Analýza exprese microRNA Doc. MUDr. Mgr. Marek Mráz, PhD Vedoucí laboratoře CEITEC MU a FN Brno 10/17 Moderní metody analýzy genomu LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie 1 • Nic si nepište…vše bude online 2  krátké RNA molekuly ~22 nukleotidů  komplementární vazba k cílové mRNA  inhibují translaci a snižují stabilitu mRNA microRNA (miRNA) microRNA DNA mRNA PROTEIN • Lidské miRNA geny: cca 2000 Stovky evolučně konzervovaných microRNA Mraz et al., 2010 3 courtesy of F. Slack 4 5 Genomic Organization of miRNA Genes Zhao Y, Srivastava D, TIBS 32:189,2007 •Intronic miRNAs often in antisense direction, made from own promoter •Exonic miRNAs - non-coding (or in alternatively spliced exons) miRBase http://www.mirbase.org/ miRNAs as Oncogenes and Tumor Supressors Zhang et al Dev Biol. 2007 Feb 1;302(1):1-12 microRNA DNA mRNA PROTEIN mRNA neznamená, že v buňce bude i protein Historicky vždy velká neshoda mezi daty z expresních čipů a expresí proteinů (Western Blot) 9 Specifika analýzy exprese microRNAs: o velmi malé molekuly – 22nt – specifikum izolace, specifické značení i design sond o malé zastoupení ve vzorku – separace microRNA o v lidském genovu cca 2000 genů o některé mají velmi podobnou sekvenci – rozdíl 1nt o pre-miR, pri-miR, mature-miR o málo se ví o jejich funkcích – obtížná interpretace výsledků o zatím málo zkušeností a standardizace Izolace NGS Real-Time PCR Microarrays 10 1/ Izolace a stabilita microRNA Problémy: velikost 22nt, celkově cca 0,01% z celkové RNA Izolace: TRIzol/TriReagent miRvana (Ambion) PureLink (Invitrogen) a další Obohacení: PAGE FlashPAGE Fractionator (Ambion) Mraz et al., 2009 11 Izolace: TRIzol/TriReagent miRvana (Ambion) PureLink (Invitrogen) a další Mraz et al., 2009 12 RT-PCR Problems….? TaqMan-based real-time PCR quantification of mature miRNAs 14 Stabilita microRNA : Stabilita po izolaci Stabilita v FFPE (formalin-fixed parafin-embedded tissue) Mraz et al., 2009 RNA cDNA Bravo et al., 2007 15 Stabilita microRNA : Stabilita v FFPE (formalin-fixed parafin-embedded tissue) Jung et al., 2010 16 RNA Seq Sanger vs NGS ‘NGS has the ability to process millions of sequence reads in parallel rather than few at a time Next Generation Sequencing • Takes advantage of miniaturization to engage in massively parallel analysis – Essentially carrying out millions of sequencing reactions simultaneously in each of 10 million tiny wells • Sophisticated computer analysis of huge amounts of information allows “assembly" of a given sequence Massive Parallel Seq workflow 1) Library preparation 4) Data processing & analysis A SAMPLE 2) Cluster generation on a flow cell SE, PE reads, 50-250 bases (miseq) 3) Sequencing & imaging 21 High Parallelism is Achieved in Polony Sequencing PolonySanger This is the trick C A G T C A T C A C C T A G C G T A 5’ G T C A G T C A G T C A G T 3’ 5’ First base incorporated Cycle 1: Add sequencing reagents Detect signal Cleave terminator and dye Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat Sequencing by synthesis A C G A A A T T T T C C G G G G G C T A Emission Excitation 38 Sequencing by Synthesis - Fluorescently labeled Nucleotides (Illumina) Complementary strand elongation: DNA Polymerase video • https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM The general experimental procedure for RNA Transcriptom = sum of all RNA (mRNA, rRNA, tRNA and noncoding RNA) The general experimental procedure for miRNA The general experimental procedure for miRNA 43 44 MICROARRAYS Expression microarrays pro microRNAs: o velmi malé molekuly – 22nt – specifikum izolace, specifické značení i design sond o malé zastoupení ve vzorku – separace microRNA o v lidském genovu cca 2000 genů – menší počet sond na čipu o některé mají velmi podobnou sekvenci – rozdíl 1nt o pre-miR, pri-miR, mature-miR o málo se ví o jejich funkcích – obtížná interpretace výsledků o zatím málo zkušeností a standardizace 1. 2. 3. Li and Ruan, 2009 45 3/ Labeling – značení:  Není možný labeling pomocí značených polyT při reverzní transkripci  Přímé značení (direct labeling) – většinou nějaká fluorescenční barva  Nepřímé značení (indirect labeling) – probíhá nějaká reverzní transkripce/PCR Přímé značení: Jednoduché, rychlé a „čím méně kroků tím méně vnesených chyb a variability“ 1/ Značení guaninu v microRNA Flurochromem vážícím se na guanin jsou označeny miRNA (Ulysis Alexa Flour 546/647) Všechny lidské miRNA obsahují guanin, ale v různém množství Nemožnost usuzovat na vzájemnou expresi různých miRNA (různý obsah guaninu) (Babak et al., 2004) 2/ Značení pomocí Poly (A) polymerázy Můžu se rozhodnout jak dlouhý bude poly(A) a tím ovlivnit sílu signálu (Shingara et al., 2005) 46 4/ značení pomocí T4 ligasy Krátký značený oligonukleotid je připojen T4 ligásou k 3‘konci Výhodou je přednostní vazba na RNA o velikosti 18-30bp ->total RNA (Thomson et al., 2004; Castoldi et al., 2007) 47 Nepřímé značení: Značen je produkt reverzní transkripce či PCR Výhody: cDNA je pak stabilní a lze uchovat, Pre-amplifikace a tím snadnější detekce méně exprimovaných miRNA 1/ značení revezního transkriptu miRNA Reverzní transkripce pomocí náhodných 8-merů značených 2 biotiny (3‘-(N)8 – (A)12-biotin-(A)12-biotin-5‘ (Liu et al., 2004) Reverzní transkripce pomocí náhodných neznačených 7-merů, následně označeny s pomocí terminální transferázy a biotin-dideoxy-UTP (Sun et al., 2004) Nebezpečí chyb z nespecifické vazby primeru 2/ značení produktu RT-PCR Výhoda: snadná pre-amplifikace Dva adaptory fluorescenčně-značený primer (k adaptoru) (Miska et al., 2004) Nevýhoda: antisense strand přiromen při hybridizaci Rešením je různá délka sense a antisense ->PAGE (Baskerville, 2005) 48 3/ Microarrays/ Próby: Problémy: krátké RNA, malé rozdíly v sekvenci, Tm 49 Tm – melting temperature určité próby T – hybridizační teplota TmT ..........vyšší efektivita vazby miRNA Je třeba navrhnout próby tak,aby měly všechny podobnou Tm To se u „dlouhých“ mRNA řeší vhodným výběrem oblasti genu k němuž bude sonda komplementární nebo délkou sondy  navíc některé miRNA jsou téměr sekvenčně totožné 50 Li and Ruan, 2009 ÚPRAVA SÍLY VAZBY NUKLEOTIDŮ LNA próby (Locked Nucleic Acid) ribózový kruh je „uzamčen“ methylenovým můstkem mezi atomy 2´-O a 4´-C Použití LNA pro některé báze v próbě 51 SÍLA VAZBY: LNA vs DNA próba Tm až 720C (Castoldi et al., 2006) 52 SPECIFITA VAZBY: LNA vs DNA próba (Castoldi et al., 2006) 53 miRCURY LNA Array, Exiqon : 3 dny 54 Co se nemusí podařit: Nekvalitní RNA Nepodaří se značení Nepodaří se hybridizace Nepodaří se promývání Technická variabilita čipů je větší než ta biologická Nepodaří se validace dat pomocí RT-PCR, atd Práce s miRNA čipy je velmi obtížná. Všeobecně nižší míra standardizace. Obtížná interpretace získaných dat z pohledu biologického smyslu např. deregulace několika miRNA (nádor vs. zdravá tkáň apod.) 55 56 ODPOČINEK courtesy of G. Calin microRNA DNA mRNA PROTEIN 57 courtesy of F. Slack 58 microRNA exprese je schopná rozlišit původ nádoru Lu et al. Nature 435: 834, 2005 59 60 61 62 63 courtesy of S. Hammond courtesy of S. Hammond Chronická lymfatické leukémie  Z maturovaných B lymfocytů  Nejčastější leukémie dospělých  Extrémně variabilní prognóza  Nejčastější aberace del13q14 – obsahuje 2 miRNA (miR- 15a, miR-16) Exprese miRNA asociuje s prognostickými subtypy CLL Calin et al., 2005 Fulci et al, 2007 Zenz et al., 2009 Stamatopoulos et al., 2009 Mraz et al., 2009a, 2009b, 2012, 2014 Mutované IgHV Nemutované IgHV Delece/mutace p53 ~ 20 miRNAs n =168 Nižší hladiny miR-150 asociují s kratším celkovým přežitím a časem do první léčby Mraz et al, Blood, 2014 Jak identifikovat cíle miR-150 u CLL? (HG-U133 Plus 2.0, Affymetrix) N=32 N=32 Mraz et al, Blood, 2014 Genové expresní čipy pro CLL s nízkou vs vysokou hladinou miR-150  58 rozdílně exprimovaných genů  2 geny s evolučně konzervovanými vazebnými místy pro miR-150– GAB1 a FOXP1 GAB1 je adaptorová molekula, která je nutná k vazbě PI3K na membránu a amplifikaci BCR signalizace (Ingham et al. JBC, 2001). FOXP1 je transkripční faktor důležitý pro vývoj B lymfocytů a asociovaný s ABC DLBCL a progresí B buněčných lymfomů (Hu et al. Nat Immunol, 2006). Adaptivní imunity- centrální dráha BCR B cell receptor (BCR) GAB1 P P P P SHIP SHP1 FcγRIIB PIRB CD22 BCR Igα Igβ LYN SYK BTK BLNK PLCγ2 PI3K SHP1 „Negative regulators of BCR“ CD19 P P P RAS P38 MAPK NFκB AKT ERK/ ↑Ca2+ FOXP1 miR-150Pro- proliferative and anti- apoptotic pathways activated by BCR „Positive regulators of BCR“ Mraz et al, Blood, 2014 Popsali jsme první příklad regulace BCR signalizace prostřednictvím microRNA Kater and Eldering, BLOOD, 3 JULY 2014 x VOLUME 124, NUMBER 1 First description of miRNAs role in BCR signalling…not only in CLL miRNAs přispívají k regulaci mnoha drah miR_terapie • potentially usefull as therapeutic targets 76 77 Díky za pozornost Marek.Mraz@email.cz Hledáme nadšené studenty (Bc, Mgr, PhD) a post-doky CEITEC MU Mraz Lab: Katerina Cerna, Katerina Musilova, Vasek Seda, Gabriela Pavlasova, Veronika Svobodova, Sonali Sharma, Jan Oppelt 79 MICRORNAS EXPRESSION IN THE REGULATION OF P21 IN HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS Dasa Dolezalova Marek Mraz 80 MicroRNAs expression in the regulation of p21 in human embryonic stem cells 81 MicroRNAs expression in the regulation of p21 in human embryonic stem cells 82 Differences in microRNA expression in hESC vs NPCs 83 Induction of microRNAs after DNA damage in hESCs 84 MicroRNA pathway regulates p21 85 MicroRNA pathway regulates p21: miR-302s contribute 86 Conclusion 87 miR-15-16 are deleted in 60% of CLL cases (Calin et al., 2002) Chronic lymphocytic leukemia (CLL)  Prototype disease  Most frequent leukemia in adults  Extremely variable survival (months vs. dozens of years)  No unifying genetic abberations (most frequently del 13q14) Mutated IgVH Unmutated IgVH Deletion/mutation p53 Trbusek et al., JCO, 2011 Mutated IgVH Unmutated IgVH Deletion/ mutation p53 miR-34a Mraz et al., Leukemia 2009 Mraz et al., Leukemia and Lymphoma, 2009 (i) microRNAs and DNA-damage response in CLL del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 wtTP53 wtTP53 wtTP53 wtTP53 wtTP53 89  miR-34a is transcriptionally activated by p53 protein (He et al., 2007)  miR-34a is abnormally expressed in leukemia patients Mraz et al., Leukemia 2009 Mraz et al., Leuk Lymphoma, 2009 Asslaber et al., Blood, 2010 (i) microRNAs and DNA-damage response in CLL He et al., 2007 90 miR-34a clinical assay University of California, Mayo Clinic, University of Salzburg, European Research Initiative on CLL P=0.03 r2 = 0.995 LAB RESEARCH DIAGNOSTIC TEST CLINICAL TRIALS n=200 91 DNA damage response  In vivo samples from ~100 leukemia treated patients  large scale search for miRNAs that are activated after chemo-immuno therapy in vivo  Application of miRNAs as predictive and prognostic markers 92 • Definování expresního profilu miRNA u pacientů s CLL a delecí/mutací p53 genu. Mraz et al., Leukemia 2009 Mraz et al., Leukemia&Lymphoma, 2009 Mraz et al., BBRC, 2009 Mraz et al., 2012 Mraz et al., 2013 Tab. 1 Exprese microRNA u pacientů s nepříznivýni prognostikými markery (nemutované IgVH a delece/mutace p53) (dle 1 Calin, 2005; 2 Mraz, 2009b) MicroRNA Chromozomáln í oblast Exprese miRNA u CLL vzorků s: nemutovaným IgVH (ZAP70+) vs. mutovaným IgVH (ZAP70-) delecí/mutací p53 (bez ohledu na IgVH) vs. wild-type p53 (bez ohledu na IgVH) miR-15a 13q14 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-16-1 13q14 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-16-2 3q26 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-23b 9q22 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-24-1 9q22 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-29a-2 7q32 NÍZKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-29b-2 1q32 NÍZKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-29c 1q32 NÍZKÁ1 NÍZKÁ2 miR-146 5q34 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-155 21q21 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-195 17p13 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-221 Xp11.3 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-223 Xq12 NÍZKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-34a 1p36 NEZMĚNĚNA2 NÍZKÁ2 miR-17-5p 13q31 NEZMĚNĚNA2 NÍZKÁ2 miR-142 NÍZKÁ2 NEZMĚNĚNA2 Je to k něčemu dobré i v medicíně? 93 • potentially usefull as therapeutic targets 94 Calin et al., 2008 95 Děkuji za pozornost Marek Mráz marek.mraz@email.cz LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie 96 MicroRNA-650 Expression Is Influenced by Immunoglobulin Gene Rearrangement and Affects the Biology of Chronic Lymphocytic Leukemia Marek Mraz1,2, Dasa Dolezalova3, Karla Plevova1,2, Katerina Stano Kozubik1,2, Veronika Mayerova1,2, Katerina Cerna1,2, Katerina Musilova1,2, Boris Tichy1,2, Sarka Pavlova1,2, Marek Borsky2, Jan Verner1,2, Michael Doubek1,2, Yvona Brychtova2, Martin Trbusek1,2, Ales Hampl3, Jiri Mayer1,2, Sarka Pospisilova1,2 Blood, epub ahead of print 97 IgL locus structure Das et al., 2009 miR-650 identified by miRAGE clonig approche in colorectal cells (Cummins et al., 2006) miR-650 is expressed in:  breast cancer cells (Chien et al., 2011)  gastric cancer cells (Zhang et al., 2011)  colon cancer cells (Cummins et al., 2006)  melanoma cells (Chan et al., 2011) 98  Associated with IgG production and V(D)J recombination (Koralov, 2008;Vigorito, 2007) MicroRNAs regulate production of imunoglobulins Lindsay, 2008 99 High expression of miR-650 in cells utilizing: V2-8, V2-14, V2-5, V2-18, V2-23 subgenes for IgL Mraz et al., Blood, 2012 100 Lambda locus rearrangement utilizing V2 family is coupled with activation of miR-650 expression 101 Mraz et al., Blood, 2012 Expression miR-650 is associated with CLL prognosis higher expression is favorable 102 Mraz et al., Blood, 2012 miR-650 reduces the proliferative capacity of B-cell proliferation miR-650 inhibits cell cycle progression by regulating p16INK4-mediated pathway (Chien et al., 2011) 103 Mraz et al., Blood, 2012 miR-650 regulates CDK1, ING4 and EBF3 in B-cells ~50% of predicted targets of miR-650 are expressed in B-cells with numerous being important in B-cells physiology (Gene Ontology and Functional analysis by DAVID tool). miR-650 regulates the Cyclin Dependent Kinase 1 (CDK1) in breast cancer cells (Chien etal., 2011) Inhibitor of Growth 4 (ING4) in gastric cancer cells (Zhang et al., 2011) The EBF3 protein is a putative target with the highest score (TargetScan) 104 Mraz et al., Blood, 2012 miR-650  V2 family of subgenes for lambda IgL includes homologues of miR-650  coupled activation of miR-650 expression with IgL expression  miR-650 is associated with CLL prognosis  miR-650 regulates proliferation of B-cells  targets for miR-650: CDK1 (Cyclin Dependent Kinase 1) ING4 (Inhibitor of Growth 4) EBF3 (early B cell factor) DISCRIPTION OF A UNIQUE MECHANISM OF MICRORNA EXPRESSION COUPLED WITH IMMUNOGLUBULIN EXPRESSION Conclusion (I) 105