Masivně paralelní sekvenování Boris Tichý Sdílená laboratoř Genomika Brno, 2.10.2017 2 Informace je uložená v DNA Informace uložená jako sekvence bazí A, C, G, T V každé lidské buňce je ~ 3 miliardy bazí = ~ 3 metry = ~ 6.6 pikogramů Sekvence DNA je v každé bunce stejná 3 Sekvenování DNA Vytvoření různě dlouhých fragmentů DNA Dideoxy-NTPs → ukončení polymerace Gel → kapilární elektroforéza Značené primery nebo ddNTPs https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ https://www.youtube.com/watch?v=e2G5zx-OJIw 4 Masivně paralelní sekvenování PCR amplifikace jednotlivých DNA fragmentů nebo Sekvenování jednotlivých DNA fragmentů = Single molecule sequencing Sekvence je čtena při syntéze nového řetězce Technologie a přístroje přizpůsobeny paralelizaci Stovky milionů jednotlivých PCR reakcí a sekvenací najednou (běžně prodávané kapilární sekvenátory jsou max. 96-kapilární) Většinou kratší sekvence – desítky bazí (kapilární – běžně až 1000 bazí) Masivně paralelní sekvenování Sequencing by synthesis Polymeráza Sestavování nového řetězce z jednotlivých nukleotidů Sequencing by ligation Ligáza Sestavování nového řetězce z oligonukleotidů Non-enzymatic sequencing Nanopory, elektronová mikroskopie Přímé čtení sekvence 6 Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace 7 Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Patterned flowcell + exclusive amplification https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8 https://www.youtube.com/watch?v=DJQn-qA6tTw 8 Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Sekvenování s reverzibilními terminátory 9 Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina HiSeq X Ten – kapacita 18.000 genomů ročně, cena za genom $1.000, cena $10M HiSeq 4000 Kapacita 12 genomů/běh (24/týden), 1,5TB/běh NextSeq 500 Kapacita 1 genom/běh (3/týden), 120GB/běh MiSeq Kapacita 0,15 genomu/běh, 15GB/běh NovaSeq Kapacita 16 genomů/běh, 2TB/běh (48 genomů/6TB brzy) MiniSeq Kapacita 0,07 genomu/běh, 7,5GB/běh 10 Masivně paralelní sekvenování Technologie Ion Emulzní PCR 11 Masivně paralelní sekvenování Technologie Roche/454 Pyrosekvenování https://www.youtube.com/watch?v=rsJoG-AulNE Masivně paralelní sekvenování Technologie Ion Torrent https://www.youtube.com/watch?v=ZL7DXFPz8rU&t Masivně paralelní sekvenování Technologie Ion Torrent Ion Torrent PGM Kapacita 2GB/běh Ion S5 Kapacita 10+GB/běh Ion Proton Kapacita 10+GB/běh 14 Masivně paralelní sekvenování Qiagen GeneReader Uzavřená technologie emPCR + SBS 15 Masivně paralelní sekvenování Sekvenování (hybridizací a) ligací 16 Masivně paralelní sekvenování Class IIs restriction endonucleases 400 – 500 bp Technologie cPAL 17 Masivně paralelní sekvenování Technologie cPAL 18 Masivně paralelní sekvenování Technologie cPAL > 2,5 miliardy jamek na ploše velikosti podložního sklíčka (rozestup 0,7 mikrometru) 19 Masivně paralelní sekvenování Technologie cPAL Kompletní systém pro sekvenování lidských genomů a exomů Výrobce BGI (Čína) Kapacita 12.000 genomů/rok, cena $ 12M 20 Masivně paralelní sekvenování Technologie cPAL BGISEQ-500 Kapacita až 200GB BGISEQ-50 Kapacita až ?GB http://www.seq500.com/en/portal/videos.shtml 21 Masivně paralelní sekvenování Technologie SMRT (Single Molecule Real Time) With an active polymerase immobilized at the bottom of each ZMW, nucleotides diffuse into the ZMW chamber. In order to detect incorporation events and identify the base, each of the four nucleotides A, C, G and T are labeled with a different fluorescent color. Since only the bottom 30nm of the ZMW is illuminated, only those nucleotides near the bottom fluoresce. http://www.pacb.com/smrt-science https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI 22 Masivně paralelní sekvenování Oxford Nanopore https://www.nanoporetech.com https://www.youtube.com/watch?v=hs0FdiTHMbc https://www.youtube.com/watch?v=GUb1TZvMWsw 'Strand sequencing' is a technique that passes intact DNA polymers through a protein nanopore, sequencing in real-time as the DNA translocates the pore. SmidgION MinION GridION PromethION 23 Masivně paralelní sekvenování ReadCoorFluorescent In Situ Sequencing 24 Kontrola kvality vzorku Metody Spektrofotometrie Fluorimetrie Elektroforéza PCR/qPCR Problematické vzorky FFPE – fragmentace, modifikace Rostliny – kontaminace Tkáně – fragmentace ... 25 Kontrola kvality vzorku NanoDrop Trinean DropSense Substrakce kontaminant … Spektrofotometrie 26 Kontrola kvality vzorku Qubit Fluorimetrie Fluorescenční barviva Aktivace vazbou s DNA/RNA PicoGreen RiboGreen OliGreen Kvantifikace neovlivněná kontaminanty Selektivní kvantifikace dsDNA, ssDNA, RNA 27 Kontrola kvality vzorku Elektroforéza Integrita (fragmentace) Kontaminace Koncentrace Agarosový gel Fragment Analyzer BioAnalyzer TapeStation ... 28 Kontrola kvality vzorku PCR/qPCR Kontrola integrity PCR produkty různých délek Kvantifikace Detekce PCR inhibitorů Děkuji za pozornost Středoevropský technologický institut c/o Masarykova univerzita Žerotínovo nám. 9 601 77 Brno, Česká republika www.ceitec.cz | info@ceitec.cz