Moderní metody analýzy genomu: aplikace technologie NGS doc. Mgr. Martin Trbušek, Ph.D. D:\Disk Google\FN_disk D\Loga\FN Brno_modra_obdelnik_maly.JPG Interní hematologická a onkologická klinika, FN Brno Lékařská fakulta MU Obsah •Metodické přístupy NGS v onkologii •Somatická mutační teorie vzniku nádorů •Současné využití NGS v biomedicíně a onkologii •Zkušenosti našeho pracoviště s NGS • • Stratton et al., Nature 2009 Vývoj sekvenování DNA Sangerovo sekvenování – klasický gel Výsledek obrázku pro sanger sequencing gel Výsledek obrázku pro frederick sanger Frederick Sanger University of Cambridge PAGE značení 35S Simon et al., Nat Rev Drug Discovery 2013 Varianty NGS: analyzovaná oblast Genom Exom Amplikon Transkriptom •SNV = single nucleotide variants (mutace/SNP) •CNV = copy number variation (inzerce/delece) •strukturní aberace (translokace/inverze) •genová exprese (mRNA) •epigenetika (metylované oblasti) •interakce DNA-protein •analýza technologie CRISPR Využití NGS vedle sekvenování Somatic mutation theory (SMT) vs. Tissue organization field theory (TOFT) Sonnenschein and Soto, Progress Biophys Mol Biol, 2016 Šmardová and Koptíková, Klinická onkologie 2016 Původ nádorů: koncepční teorie SMT: Základní nastavení buňky je klidové stádium a rakovina představuje „únik“ z tohoto stavu. Maligní buňka vykazuje – díky svým genetickým změnám - selektivní výhodu růstu oproti zdravému protějšku. TOFT: Základní nastavení buňky je nekonečná proliferace (blbost?....možná ne……) Jsou to naše tkáně, kdo drží buňky pod kontrolou (v klidu) a jejich dezorganizace vede k „obnově“ buněčného dělení Celogenomové sekvenování (WGS) Sekvenace celé chromozomální DNA ® úplná informace o genomu (pokryty i promotorové a regulační sekvence) • 1.De novo asembly - využívá překryvů sekvencí, předpokladem dostatečné pokrytí (>10x) 2.Resekvenování - mapování na referenční sekvenci Celogenomové sekv. od ~ $10.000 (výzkum od $4.000) Využívá se nejčastěji k identifikaci nových nebo vzácných mutací, chromozomálních přestaveb, pro nalezení nových potenciálně terapeutických cílů WGS a analýza nádorů z různých tkání „Driver“ mutace vs. „Passenger“ mutace Driver geny: ~125 71 TS/54 ONC PRINCIPY DARWINOVSKÉ SELEKCE Vysoce variabilní počet mutací Celogenomové sekv. od ~ $10.000 (výzkum od $4.000) Využívá se nejčastěji k identifikaci nových nebo vzácných mutací, chromozomálních přestaveb, pro nalezení nových potenciálně terapeutických cílů 12 biochemických drah narušených u nádorových buněk Interpretace WGS 99.9% všech identifikovaných změn neposkytuje žádnou selekční výhodu Mutabilita lidského genomu je normální. Nicméně normální je také to, že se tělo dokáže zbavit narušených buněk pomocí kontinuálně probíhající apoptózy…. Celogenomové sekv. od ~ $10.000 (výzkum od $4.000) Využívá se nejčastěji k identifikaci nových nebo vzácných mutací, chromozomálních přestaveb, pro nalezení nových potenciálně terapeutických cílů Základní „schopnosti“ nádorových buněk Hanahann and Weinberg, Cell, 2001 Další definované znaky nádorových buněk Hanahann and Weinberg, Cell, 2011 Exomové sekvenování •WES = whole exome sequencing •Sekvenování kódujících oblastí = exom (asi 1 % genomu) •Efektivnějsí než WGS: rychlost, cena, vyšší pokrytí WES a rekurentní mutace u CLL Nejčastěji mutované geny: SF3B1, ATM, TP53 Landau et al., Nature 2015 Model vzniku a progrese nádorů Bartkova et al., Nature 2005 Cílené sekvenování •Targeted sequencing •Princip: PCR amplifikace nebo využití cílených sond •Identifikace mutačních variant pod detekčním limitem Sangerova sekv. (až 1% při vysokém pokrytí – tzv. ultra-deep NGS) •Výhodné pro sledování klonální evoluce nádorů •Výhody oproti WGS / WES: rychlost, cena, méně prostoru pro skladování dat •Pro sekvenování velkého počtu vzorků (screening) nebo validaci genetických variant v populaci Tři způsoby přípravy knihovny 1.multiplex PCR: AmpliSeq (Life Tech.) až 6144 párů primerů 2.single-plex PCR: Microdroplet PCR (RainDance Tech.), Access Array System (Fluidigm) 3.targeted capture (cílený „záchyt“ sondami) s následnou multiplex PCR: TrueSeq Amplicon (Illumina), HaloPlex (Agilent Tech.), SeqCap EZ technology (Roche NimbleGen) 1. AmpliSeq-, 10 ng vstupní DNA Count Coverage Frequency Gene_function RefGene Exon_number cDNA Codon 1752 1752 100 exonic ATM exon40 c.5948A>G p.N1983S 2261 2452 92,21 exonic ATM exon22 c.3161C>G p.P1054R 690 2962 23,3 exonic ATM exon50 c.7311C>A p.Y2437X 100 1203 8,31 exonic ATM exon24 c.3433_3435del p.1145_1145del 74 1433 5,16 exonic ATM exon30 c.4578C>T p.P1526P 46 1281 3,59 exonic ATM exon43 c.6258T>A p.Y2086X 243 8231 2,95 splicing ATM exon19 c.2921+1G>A p.P962Q 19 699 2,72 exonic ATM exon25 c.3705_3709del p.P1235fs 25 1087 2,3 exonic ATM exon5 c.480delT p.S160fs 24 1046 2,29 exonic ATM exon5 c.483G>C p.Q161H 67 3357 2 exonic ATM exon26 c.3837G>A p.W1279X 73 5626 1,3 exonic ATM exon26 c.3952_3960del p.1318_1320del 64 5151 1,24 exonic ATM exon49 c.7181C>T p.S2394L 11 904 1,22 exonic ATM exon63 c.9022C>T p.R3008C 42 3514 1,2 exonic ATM exon10 c.1402_1403del p.K468fs Výstup cíleného NGS (gen ATM) Klinické využití NGS •Nejvhodnější „targeted capture“ •Komerční kity: •diagnostické kity (panely genů různých onemocnění) •nádorové panely (záchyt hereditárních nádorových onemocnění) •panely genů dle přání zákazníka (až příliš mnoho nabídek…) • Klinickému využití nejlépe vyhovují techniky targeted capture, jelikož jsou vhodné pro sekvenování stovek genů v malém, ale i větším počtu vzorků. Příprava knihovny zabere pouze jeden den. Senzitivita a specificita je srovnatelná. Dědičné nádory (včetně zárodečných nádorových syndromů) 5-10% všech případů rakoviny Např. syndrom Li-Fraumeni asociovaný s mutacemi v TP53 nebo xeroderma pigmentosum zahrnující mutace v genech pro opravu DNA Sporadické nádory – zbytek, původ v somatické tkáni Genetické defekty jsou příčinou v obou případech; Navíc, 15-20% nádorových onemocnění zahrnuje infekční agens e.g. vysoce rizikové HPVs u karcinomu děložního čípku Původ rakoviny: role přímé dědičnosti Transkriptom = soubor všech molekul RNA (mRNA, rRNA, tRNA a noncoding RNA) Sekvenování transkriptomu (RNA seq) Wang et al. Nat Biotechnol 2009 Analýza fúzních (driver) genů (Specifická) etiologie dětských leukémií Greaves, Nat Rev Cancer 2016 https://media.springernature.com/m685/nature-assets/nrc/journal/v6/n3/images/nrc1816-f1.jpg Analýza „Guthriho kartiček“ nebo pupečníkové krve …u jednovaječných dvojčat Aberantní exprese u CLL lymfocytů (RNA seq) Ferreira et al., Genome Res 2014 Identifikace mutací SF3B1 u CLL: synergie různých přístupů NGS Quesada et al., Nat Genet 2011 NGS a epigenetika (metylace DNA) Bisulfitová konverze + NGS: •konverze C ®U, Met-C se nemění •přesná identifikace jednotlivých metylovaných bazí Výsledek obrázku pro bisulfite sequencing •Epigenetické umlčení tumor-supresorových genů (metylace promotorů) •Globální (celogenomová) hypometylace Konvertovany C na U je detekovan v sekvenci jako T, zatímco metylovany C se nemeni a je detekovan jako C. Chromatinová imuno-precipitace (ChIP-Seq) •Sledování interakcí mezi proteiny, DNA a RNA ® vazebná místa pro TF, histony, a další proteiny •Regulace genové exprese, epigenetické modifikace chromatinu Mundade et al., Cell Cycle 2014 Kombinace chromatinové imunoprecipitace a paralelního sekvenování. Reálné výstupy aplikace NGS Ellegren-druhova diverzita lejsku Studium druhové diverzity (genotypizace): •fylogeneze živočišných druhů (Ellegren et al., 2012) •identifikace nových virových variant (Kapgate et al., 2015) •šlechtění plodin v zemědělství (Fridman et al., 2012) • Mezioborové využití NGS Ellegren-druhova diverzita lejsku Metagenomika: studium mikrobiálního složení v různých typech prostředí (střevní mikroflóra, zubní plak, půda, korálové útesy, mořské dno) •bez potřeby kultivace •identifikace patogenů, virulence, rezistence, atd. Padmanabhan et al., J Microbiol Methods 2013 NGS a forenzní genetika Analýza stop z místa činu Polymorfní místa v genomu Borsting and Morling, Next generation sequencing and its applications in forensic genetics. Forensic Int Sci Genet, 2015 Výsledek obrázku pro forensic ngs Aplikace forenzni genetiky: DNA databáze, identifikace osob/druhů (STR=single tandem repeats, miRNA, SNP/zivocisne, bakterialni, roslinne druhy na miste cinu), příbuzenské vztahy, odlišení jednovaječných dvojčat, … Využití v medicíně •molekulární diagnostika dědičných chorob a infekčních onemocnění •prenatální diagnostika (neinvazivní, z fetální DNA v mateřské plazmě) •farmakogenomika (identifikace nových terapeutických cílů, studium rezistence) •Onkologie; bezbřehé možnosti! Optimální využití NGS: personalizovaná léčba Guan et al., Chin J Cancer 2012 Integrace omických dat: U daného pacienta je osekvenován nádorový a zdravý genom. Genetická informace je analyzována a interpretována multidisciplinárními experty. Pacientovi je navržena léčba „šitá na míru“. Z analýzy profi tuje také pacientova rodina, protože se zjistí i hereditární riziko vzniku nádorového onemocnění a mohou být provedena příslušná opatření První projekt WGS u nádorového onemocnění Porovnání nádorových a zdravých buněk pacienta s AML ® identifikace dvou známých a osmi nových somatických mutací (Ley et al., Nature 2008) International Cancer Genome Consortium (ICGC): Cancer Genome Project – charakterizace genomických, transkriptomických a epigenomických změn u 50 nejčastějších nádorových onemocnění 14 zemí, sekretariát Toronto, Kanada Využití NGS v experimentální a klinické onkologii National Cancer Institute (NCI): projekt vytvoření atlasu nádorových genů – The Cancer Genom Atlas (TCGA) za účelem zlepšit nádorovou prevenci, včasnou detekci a léčbu Skrínink nových léků na panelu 60 buněčných linií → syntetická letalita Studium klonální evoluce AML pomocí WGS Identifikace somatických mutací objevujících se při relapsu (selekce cytotoxickou terapií) Ding et al.,Nature 2012 Klonální architektura CLL – časné klonální (del13q, tri12, MYD88) a pozdější sub-klonální (TP53, SF3B1) aberace ® selekce léčbou a urychlení progrese Landau et al., Cell 2013 Klinický dopad sub-klonů mut-TP53 – ultra-deep sequencing (median alel. frekvence 2%) ®horší přežití pacientů, evoluce klonu při relapsu s následným vznikem chemorezistence Rossi et al., Blood 2014 Deep seq. – pokrytí min. 100x, detekce mutací v méně než 1%, hlavně pro studium klonální evoluce Zkušenosti našeho pracoviště s NGS Identifikace sub-klonů mut-TP53 před terapií CLL buňky s mutacemi v genu TP53 jsou typicky součástí tzv. minimální zbytkové choroby. Frakce buněk rezistentních na terapii je příčinou pozdějšího relapsu onemocnění. Cílem studie bylo identifikovat pacienty s minoritními mutacemi v genu TP53 již před nasazením terapie mutTP53 mutTP53 wtTP53 wtTP53 BEFORE THERAPY IN RELAPSE Malčíková et al., Leukemia 2015 Více a méně pravděpodobné scénáře selekce mutací v TP53 Malčíková et al., Leukemia 2015 Negativní dopad selektovaných mutací na přežití CLL pacientů Malčíková et al., Leukemia 2015 Přežití stanoveno od diagnózy „Mutation acquisition“ = přítomnost mutace v relapsu Analýza genů ATM, SF3B1, NOTCH1, BIRC3 u terapie FCR, BR Medián PFS (m) 2 mut. geny 21 1 mut. gen 27 Bez mutace 27 P = ns PFS dle počtu mutovaných genů PFS dle mutací v genu ATM 44 Mut-IGHV Medián PFS (m) ATM-mut 20 ATM-wt nedosažen P = 0,014 Nemut-IGHV Medián PFS (m) ATM-mut 25 ATM-wt 19 P = ns Klonální evoluce mutací TP53 a ATM 45 Klonální evoluce mutací BIRC3 a SF3B1 46 1. Muscular dystrophies 5. Other myopathies 9. Metabolic myopathies 13. Hereditary ataxias 2. Congenital muscular dystrophies 6. Myotonic syndromes 10. Hereditary cardiomyopathies 14. Hereditary motor and sensory neuropathies 3. Congenital myopathies 7. Ion channel muscle diseases 11. Congenital myasthenic syndromes 15. Hereditary paraplegias 4. Distal myopathies 8. Malignant hyperthermia 12. Motor neuron diseases 16. Other neuromuscular disorders • Neuromuskulární nemoci (NMD) Ø465 genů Ø840 typů NMD – 16 skupin •http://www.musclegenetable.fr •Klinická a genetická heterogenita Doc. RNDr. Lenka Fajkusová, CSc. 1. Muscular dystrophies 5. Other myopathies 9. Metabolic myopathies 13. Hereditary ataxias 2. Congenital muscular dystrophies 6. Myotonic syndromes 10. Hereditary cardiomyopathies 14. Hereditary motor and sensory neuropathies 3. Congenital myopathies 7. Ion channel muscle diseases 11. Congenital myasthenic syndromes 15. Hereditary paraplegias 4. Distal myopathies 8. Malignant hyperthermia 12. Motor neuron diseases 16. Other neuromuscular disorders •NMD – svalové dystrofie a myopatie •Imunohistochemická detekce alfa-sarkoglykanu (kontrola, pacient s mutacemi v genu SGCA), Western blot kalpainu-3. (FNB, PAU, Hermanová M.) Výběr genu na základě analýzy svalové tkáně (problematické - rutinně se provádí imunohistochemická detekce jen některých proteinů ….. defekt proteinu nemusí vždy korelovat s výsledkem imunohistochemie) 1)Analýza vytypovaných genů po sobě – „gene by gene analysis“, začíná se genem s nepravděpodobnějším výskytem mutace – ČASOVĚ A FINANČNĚ NÁROČNÉ 2)Analýza všech genů potenciálně asociovaných s onemocněním současně – masivní paralelní sekvenace (sekvenování nové generace) •41 + 29 + 25 + 15 + 22 ……. 132 genů ??? 1.Sekvenční varianty patogenní 2.Sekvenční varianty pravděpodobně patogenní 3.Sekvenční varianty nejasného významu 4.Sekvenční varianty pravděpodobně benigní 5.Sekvenční varianty benigní •Pravidla pro interpretaci sekvenčních variant Doc. RNDr. Lenka Fajkusová, CSc. 1.Sekvenace rRNA genů - detekce širokého spektra patogenů –– použití sekvenování 16S u bakterií (mikrobiom) a 18S u mykotických patogenů (mykobiom) – srovnání spektra detekovaných druhů u zdravých a např. chronicky nemocných – cystická fibróza, Crohnova choroba • - ? virové patogeny 2.Přímá detekce nových patogenů – doposud nepopsaných nebo obtížně kultivovatelných (pozor - chybějící sekvence v databázích – de novo sestavení genomu (?)) • • •Použití NGS – analýza mikroorganismů Doc. Mgr. Martina Lengerová, Ph.D. Lidský mykobiom •Trávící trakt - 335 druhů ze 158 rodů –221 exkluzivně ve střevě –88 exkluzivně v dutině ústní –z celkem 247 druhů nalezených ve střevě bylo vykultivováno jen 29 – zbytek pouze molekulárně biologická detekce • •výplach úst od 20 zdravých lidí - 101 druhů, 85 rodů –z toho 11 nekultivovatelných –průměrně 15 různých druhů – nejčastěji Candida, Cladosporium, následují Aspergillus, Cryptococcus, Fusarium a Alternaria, v jiné studii kromě výše uvedených nejčetnější Malassezia a Epicoccum Doc. Mgr. Martina Lengerová, Ph.D. Slabá místa NGS při využití pro klinickou diagnostiku •Vysoké „pozadí“ lidské DNA –Deplece – odstranění pomocí speciálních technik – •Bias v sekvencích? – v důsledku izolace DNA – zatím neexistuje ideální metoda zpracování DNA pro detekci • virů, bakterií a hub v jednom • •Bioinformatické zpracování – pro základní analýzy není komplikované, ale přece jen vyžaduje pokročilé znalosti • Doc. Mgr. Martina Lengerová, Ph.D. Závěr: mikrobiální NGS •Za současného stavu techniky může být NGS pouze doplňkem tradičních metod –Automatizace –Standardizace protokolů a bioinformatických nástrojů pro analýzu dat –Správa referenčních databází –Snížení nákladů a doby trvání vyšetření – •Velký potenciál má ve studiu interakcí hostitelského a mikrobiálního genomu, epidemiologie a mechanismů vzniku a šíření rezistence Doc. Mgr. Martina Lengerová, Ph.D. AZV project CELL AML (PharmDr. Martin Čulen, Ph.D.) Subproject A – Xenograft experiments (LF MU Brno) C:\Ja\SCIENCE\Output\obrazky\stick_figure.gif C:\Ja\SCIENCE\Output\obrazky\blasts.jpg NGS Sorting of human LEU (hCD45+) http://www.elta90.com/wp-content/uploads/2011/07/miseq-slide2.jpg AML LEU C:\Ja\SCIENCE\Output\obrazky\Femur_c.jpg http://www.watermarklearning.com/blog/wp-content/uploads/2013/03/stopwatch.jpg + NGS http://www.elta90.com/wp-content/uploads/2011/07/miseq-slide2.jpg Scheme Naše zkušenosti s NGS: souhrn „onkologie“ Pozitivní aspekty: •Přesnost, citlivost, dobrá reprodukovatelnost •Přijatelná rychlost Ne až tak pozitivní aspekty: •Flexibilita K vážnému zamyšlení: •Jak vysokou citlivost skutečně potřebujeme? •Jsme schopni výsledky biologicky a klinicky interpretovat? •Finanční aspekty (Illumina → monopol na trhu) •Etické otázky (zejména WES vs. predispozice) Resekvenační čipy - nutnost doprovodných analýz (sekvenování, qPCR, WB, …) Malcikova 2014: minoritní mutace už před terapií a mohou se objevit při relapsu; většina expanduje do dominantního klonu pod takem chemoterapie; častý výskyt mnohonásobných minoritních klonů Literatura •Stratton 2009: The cancer genome. •Simon 2013: Implementing personalized cancer genomics in clinical trials. •Wang 2009: RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics •Meaburn 2012: Next generation sequencing in epigenetics: insights and challenges. •Mundade 2014: Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. •Padmanabhan 2013: Genomics and metagenomics in medical microbiology. •Ellengren 2012: The genomic landscape of species divergence in Ficedula flycatchers. •Kapgate 2015: Next generation sequencing technologies: Tool to study avian virus diversity. • •Fridman 2012: Next-generation education in crop genetics. •Yang 2014: Application of next-generation sequencing technology in forensic science. •Dong 2012: Exploring the cancer genome in the era of next-generation sequencing. •Walsh 2010: Detection of inherited mutations for breast and ovarian cancer using genomic capture and massively parallel sequencing. •Koubkova 2014: Sekvenování nové generace a možnosti jeho využití v onkologické praxi •Guan 2012: Application of next-generation sequencing in clinical oncology to advance personalized treatment of cancer. •Ley 2008: DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome. • • • • • • •Ding 2012: Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. •Jardin 2014: Next generation sequencing and the management of diffuse large B-cell lymphoma: from whole exome analysis to targeted therapy. •Wang 2011: SF3B1 and Other Novel Cancer Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia •Landau 2013: Evolution and Impact of Subclonal Mutations in Chronic Lymphocytic Leukemia •Rossi 2014: Clinical impact of small TP53 mutated subclones in chronic lymphocytic leukemia. • • DÍKY ZA POZORNOST! m.trbusek@volny.cz