Sekvenační knihovny Boris Tichý Sdílená laboratoř Genomika Brno, 16.10.2017 Knihovna Soubor různých fragmentů DNA, se kterými lze pracovat jednotným způsobem Klasická DNA/cDNA knihovna Klonování genomu/cDNA do vektorů Sekvenační knihovna Přidání sekvencí, které umožňují amplifikaci (klonální) a sekvenování Sekvenační knihovny Několik stovek typů Vstup DNA, RNA, krátké RNA, crosslinkovaná DNA/RNA Přidání adaptorů Ligace, tagmentace, PCR Selekce sekvencí Hybridizace, PCR, imunoprecipitace DNA fragmentation Library preparation Mechanical Ultrasound (Covaris) Hydrodynamic Nebulization Enzymatic Restriction endonucleases Fragmentase® Transposase Illumina Cluster density depends on fragment length Short fragments cluster better Mix of longer and shorter fragments is problematic Max <1000bp Longer fragments are problematic Broader length distribution => Uneven cluster generation effectivity Problematic conc. measurment DNA AmplificationadaptorA Barcode/indexA SequencingprimerA SequencingprimerB AmplificationadaptorB Barcode/indexB Sekvenační knihovny DNA AmplificationadaptorA Barcode/indexA SequencingprimerA SequencingprimerB AmplificationadaptorB Barcode/indexB Sekvenační knihovny - Ligace Oligo BOligo B Náhodný fragment Amplikon A T T A 3 kroky: End repair A-tailing Ligation (A-T) Celé genomy Základ pro obohacování Amplikony ChIP, cDNA Library preparation LigationAdaptor structure Complementary part (12bp) Complementary part (12bp)T A) Full-length, usually single index B) Short, usually dual index Complementary part (12bp) Complementary part (12bp)T Adaptor PCR primers DNA AmplificationadaptorA Barcode/indexA SequencingprimerA SequencingprimerB AmplificationadaptorB Barcode/indexB Sekvenační knihovny - PCR Primer A Primer B Jednotlivé geny Metagenomika - 16S DNA AmplificationadaptorA Barcode/indexA SequencingprimerA SequencingprimerB AmplificationadaptorB Barcode/indexB Sekvenační knihovny – dvoukolová PCR Primer A - int Primer B - ext Primer B - int Primer A - ext Jednotlivé geny Metagenomika - 16S DNA AmplificationadaptorA Barcode/indexA SequencingprimerA SequencingprimerB AmplificationadaptorB Barcode/indexB Sekvenační knihovny - tagmentace Fragmentace a připojení části adaptorů v jednom kroku Transpozáza Dokončení pomocí PCR Molecular barcodes Library preparation Tag each input molecule with random sequence => Lower coverage for variant calling Better quantification of variants (eg. species in metagenomics) Haloplex HS SAFE-Seq DNA Primer A – int with MB Primer B - ext Primer B – int with MB Primer A - ext First round – 2 cycles ExoSAP treatment Second round Library preparation RNA Convert RNA to cDNA (double stranded) → prepare DNA library mRNA enrichment RT primer vs. polyA selection beads rRNA depletion smallRNAs Exception – ligate adaptors → cDNA → PCR Full transcriptome sequencing mRNA, all long transcripts excl. rRNA 3‘ sequencing (gene expression) smallRNA sequencing RNA Smart-Seq QuantSeq RNA Lexogen SenseRNA smallRNA Library preparation Target enrichment ChIP CLIP PCR Size selection (RNA) Hybridization with capture probes Bacterial DNA enrichment Molecular inversion probes rRNA depletion ... Hybridization Exomes, gene panels, targeted RNA-Seq In solution, on chip PCR Multiplex PCR (Illumina, Multiplicom) Massively parallel PCR (Fluidigm, Wafergen) Molecular inversion probes HaloPLEX Cílený screening Exome sequencing Všechny exprimované geny Většinou včetně nekódujících Hybridizace (v roztoku) Gene enrichment Jeden gen – např. dědičné poruchy PCR, hybridizace multiplexing Skupiny genů – např. multifaktoriální nemoci, nádory PCR, hybridizace Úseky genomu – strukturní aberace hybridizace Cílené sekvenovaní (targeted resequencing) Hybridizace Exomy, genové panely Cílená exprese (Molekulární) inverzní proby HaloPlex PCR enrichment – (masivně) paralelní PCR Fluidigm AccessArray 48x48 reakcí, objem 10nL Wafergen SmartChip TE 5184 reakcí, 100nL RainDance Až 20.000 párů primerů, miliony reakcí, objem pL Knihovny pro epigenomiku Metylace MeDIP-Seq – protilátka proti metC BS-Seq – bisulfitová konverze, rozlišení na bázi Protein-DNA interakce ChIP-Seq – crosslink DNA/protein, vychytání protilátkou Aktivní chromatin DNAse-Seq Oxford Nanopore 1D knihovny