PCR - polymerázová řetězová reakce (princip metody) PCR umožňuj e získat požadovanou sekvenci bez klonování, navíc zcela specifickou. PCR využívá základních rysů replikace DNA: Jako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární řetězec. K zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. Jako templáty pro syntézu mohou sloužit oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci. Primery se vybírají tak, aby se připojovaly k místům ohraničujícím z obou stran amplifikovaný úsek. Teoreticky lze získat 2n řetězců (kopií), což vede k nesmírně rychlé amplifikaci původní molekuly. Provedení reakce Výchozím materiálem pro PCR je DNA obsahující sekvenci určenou k amplifikaci. Tuto sekvenci není nutné izolovat - výběr zajistí primery. Jako vzorek je možné použít i biologický materiál (DNA není nutné purifikovat). Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle postačuje méně než 1 mg genomové DNA, teoreticky postačuje jedna molekula. Reakční směs obsahuje: 1. DNA 50 ng - 1 ug mikroorganismy, tkáňové kultury, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stery, vlasy, atd. 2. Primery. Primery pro PCR mívají velikost 10 - 40 bp s obsahem GC mezi 40% - 70%. 3' konec primeru nesmí být komplementární k žádné části sebe sama (self-complementatity). Primer nesmí obsahovat palindromy a tvořit stabilní sekundární struktury. Oba primery by měly mít přibližně stejný obsah GC a podobnou teplotu annealingu (Ta). K navrhování primerů se používají počítačové programy, z nichž některé jsou volně dostupné. 3. dNTP ve formě Na nebo Li solí, koncentrace v reakci je 0,1 - 0,2 mM. 4. Mg+ ionty. Přítomnost Mg iontů v reakci je nezbytná, jejich množství závisí na množství DNA a dNTP v reakci. V jejich nepřítomnosti se netvoří žádný produkt, v nadbytku vznikají nespecifické produkty. Optimální koncentrace se stanovuje experimentálně pro každý pár primerů zvlášť. 5. DNA polymerázu Taq Thermus aquaticus Tth Thermus thermophilus Tma Thermotoga maritima Princip: 1. denaturace 95 °C (separace řetězců) 2. připojení primerů (30 - 65 °C) teplota určije specifičnost a závisí na sekvenci primeru. Ta = Tm - 5 °C 3. polymerační reakce (65 - 75 °C) 4. nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus Cyklické střídání teplot jednou založené směsi zajišťuje průběh reakce PCR, provádí se v termocyklerech, většinou se provádí 25 - 60 cyklů. Jako polymeráza se používá Taq DNA polymeráza z Thermus aquaticus, která odolává teplotě 94 °C. Protokol PCR Detekce genu pro: Režim termocykleru: Složky reakční směsi Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace Množství přidané do 25 |Lil 1 vzorek Množství přidané do \ú .........vzorků Deionizovaná sterilní H20 Pufr pro PCR bez MgCl2 10x lx PufrproPCR sl5mMMgCl2 MgCl2 25 mM / 50 mM 1,5 mM dNTP 10x 15 mM lx /200 \jM BSA/želatina Primer F 100 \jMI 10 \M 0,4 \iM Primer R 100 \jMI 10 \M 0,4 \iM Taq DNA-polymeráza 5 U ni"1 1 U Templátová DNA 50 ng ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PŘI STANDARDNÍ PCR Problém Možná příčina Doporučení Nevzniká produkt Nevyvážená reakce • Kontrola koncentrace jednotlivých složek Teplotní podmínky • Kontrola nastavení cyklů Nízká koncentrace templátu • Zvýšit koncentraci templátové DNA Koncentrace primem nebo jeho sekvence • Optimalizovat koncentraci primem • Navrhnout primer s novou sekvencí Různé faktory • Testovat reakci s pozitivní kontrolou a funkčními primery • Začít s novými roztoky, H20 a enzymem Nízká kvalita templátu (degradovaný, kontaminovaný, obsahující inhibitiry) • Použít primery, které amplifikují kratší úseky • Přidat pomocné látky (DMSO) • Optimalizovat koncentraci Mg2+ • Připravit nový templát • Zamezit častému zmrazování a rozmrazování templátu Nízká účinnost polymerázy • Používat pozitivní kontrolu • Zvýšit počet cyklů • Zvýšit koncentraci enzymu • Použít jinou polymerázu Produkt není čistý Vzniká sekundární amplifikační produkt • Kontrola koncentrace složek reakce • Optimalizovat koncentraci Mg2+ • Optimalizovat koncentraci primem • Snížit počet cyklů • Smížit koncentraci templátu Vznikají četné nespecifické produkty Nespecifická vazba primem • Použít vyšší teplotu Ta • Optimalizovat koncentraci primem • Použít „hot start" • Narhnout nové primery Polymerázová řetězová reakce PCR (Polymerase Chain Reaction) i Princip PCR ■ Zavedení PCR v roce 1983 (Kary Mullis) ♦ Publikace ♦ Nobelova cena ■ Metoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace. ■ K opakující se enzymové syntéze komplementárních řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA dochází po připojení dvou primem vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3'-OH-konce směřují proti sobě. ■ PCR umožňuje získat požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování. ■ PCR využívá základních rysů replikace (enzymatické syntézy) DNA: ♦ Jako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární řetězec. ♦ K zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. ♦ Jako templáty pro syntézu mohou sloužit oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci. ■ Primery se vybírají tak, aby se připojovaly k místům ohraničujícím z obou stran amplifikovaný úsek. ■ Teoreticky lze získat 2n řetězců (kopií). ■ Předpoklady pro zavedení PCR ♦ Syntéza oligonukleotidů ♦ Vlastní myšlenka (K. Mullis) ♦ Teplotně stabilní DNA polymeráza ♦ Automatické termocyklery Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzymů templát vedoucího řetězca svírá cí DNA-polymeráza protein na vedoucím řetězci rodičovská DNA DNA-helikáza primáza vazebný protein pro jednoduchý řetězec templát pro váznoucí řetězec DNA-polymeráza na váznoucím řetězci Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym ■ Reakční směs obsahuje: ♦ Templátovou nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA). ♦ Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle postačuje méně než 1 jug genomové DNA, teoreticky postačuje jedna molekula. • Kvalita templátu ovlivňuje výsledek PCR. • Velké množství RNA může vázat ionty Mg2+ • znečištěný templát může obsahovat inhibitory PCR ♦ Zdroj: mikroorganizmy, buňky z tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stery, vlasy, atd... ■ Primery. Chemicky syntetické ologonukleotidy o velikost 10-30 nukleotidů. ■ dNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí ■ Mg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza. ■ Termostabilní DNA polymerázu, která odolává teplotám až 98 °C ♦ Taq Thermus aquaticus ♦ Tth Thermus thermophilus ♦ Tma Thermotoga maritima ♦ Pfu Pyrococcus furiosus ♦ Pwo Pyrococcus woesei Syntéza obou řetězců u specifické sekvence Přímý primer anips 5' 3' ttgagaaaggaataagc - dna pol -»• aactctttccttattcgtcttaagcaaggtttttcttactcgacaacaaacgtctttagctcatatacg ttgagaaaggaataagcagaattcgttccaaaaagaatgagctgttgtttgcagaaatcgagtatatgc *-DNA POL - tctttagctcatatacg ■ * F3' c, Zpětný primer ttgagaaaggaataagcagaattcgttccaaaaagaatgagctgttgtttgcagaaatcgagtatatgc aactctttccttattcgtcttaagcaaggtttttcttactcgacaacaaacgtctttagctcatatacg ttgagaaaggaataagcagaattcgttccaaaaagaatgagctgttgtttgcagaaatcgagtatatgc aactctttccttattcgtcttaagcaaggtttttcttactcgacaacaaacgtctttagctcatatacg REAKCNI PODMÍNKY PCR 1. Počáteční denaturace DNA. Důležitá je kompletní denaturace templátu, obvykle postačuje zahřátí směsi na 2 - 5 min / 95 °C. V případě, že dojde pouze k částečné denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují a to vede k nespecifické vazbě primerů („self-priming") a možným falešným výsledkům. Vlastní řetězová reakce:_ 2. Denaturační krok (separace řetězců) : 94 - 95 °C / 20 - 45 s, záleží na objemu reakce, tloušťce stěn zkumavek. Nedostatečně denaturovaná DNA neumožňuje přístup primerům, naopak příliš dlouhá denaturace snižuje aktivitu DNA polymerázy (stabilní cca 2 hod / 98 °C). 3. Připojení primerů (55 - 65 °C / 30 - 90 s) teplota určuje specifičnost a 0x závisí na Tm primeru a templátu. Pro oba primery by měla být Tm podobná. Ta se optimalizuje v teplotním gradientu nebo se stanovuje empiricky. 4. Prodlužování primeru (polymerační reakce) při standardní PCR probíhá při 72 °C /45 - 90 s. Taq DNA polymeráza syntetizuje DNA při této teplotě rychlostí cca 60 bází/s. Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus._ Cyklické střídání teplot jednou založené směsi zajišťuje průběh reakce PCR, provádí se v termocyklerech, většinou se provádí 25 - 35 cyklů. 5. Závěrečná extenze se provádí obvykle po posledním cyklu (72°C / 5 min) a slouží k dokončení syntézy a renaturaci jednořetězcových produktů. REAKCNI PODMÍNKY PCR Denaturace vzorku DNA Pro oddělení jednořetězců (94 °C, 5 min) . Připojení primerů na řetězce DNA 1 (30 - 65 °C, 1 min) Denaturace pro separaci ^jj- řetězců DNA — OO X (94 °C, 30 s) Syntéza nových řetězců DNA polymerázou (72 °C, 45s - 2 min) START a g a g M,I, I, I,I, M', dna fragment g 1 a a c im jjRIMERS ±±±* + ■ m 1*,+*- DNA (^POLYMERASE 11 i BASES I C 11, i A ' l g a t t i 1X11 ŠV%W g a CfvCHlSrOLilKWice DNA / \ zahFiAtI k odděleni hetezcú HYBHIDIZACE PR1MERÚ T líilym dATF tSGTP dCTP dTTP t DNA pnlymflrAZa +rJATF +dGTP +dCTP ■kITTP DNA z příměrů 2. krok první cyklus oddelení 'e tŕne u DNA a I)' Oiľi i-.11:"i-■i ■. syntéza ONA tofůzců DNA 9 svázaní s primárom DNA oddelení tetäZCĹi DNA A luéJůň i ■N. DN A-oligonu kleotidové primáry oblast tfvoufe lícová cľiromosomálnŕ dna kterou / .y y pevní cyklus (tvorba dvou dvuuftf tacových nnůlůku i dna) druhý cyklus [tvorbe čtyř dvouŕelercovýGľ) molekul DNA) thrtí cyklu* (tvorba os mi dvoutotezcových ňiňlfikul DNA) KONCENTRACE JEDNOTLIVÝCH SLOŽEK PŘI STANDARNÍ PCR REAKCI DNA. Pro standardní PCR se doporučuje následující množství DNA podle velikosti templátu: ♦ lidská genomová DNA: 100 - 500 ng ♦ bakteriální DNA: 1 - 10 ng ♦ plazmidová DNA: 0,1 - 1 ng Primery. Sekvence a koncentrace primeru významně ovlivňuje výsledek PCR. ♦ Optimální koncentrace je mezi 0,1 a 0,6 uM ♦ U některých systémů může vyšší koncentrace (až 1 u.M) zlepšit výsledky. ♦ Nižší koncentrace vede k předčasnému vyčerpání primerů a snížení výtěžku. dNTP. Výsledná koncentrace se může pohybovat v rozmezí 50 - 500 |iM (pro každý nukleotid) ♦ Nejběžnější koncentrace dNTP je 200 uM Při zvýšení koncentrace dNTP je třeba zvýšit koncentraci Mg2+ iontů. Počet nově syntetizovaných molekul dsDNA při jednotlivých cyklech PCR 2n-1 Počet nových Cyklus číslo dvouřetězcových molekul 1 3 3 7 4 15 5 31 63 7 127 8 255 511 10 1 023 11 2 047 12 4 095 13 8 191 14 16 383 15 32 767 16 65 535 17 131 071 18 262 143 19 524 287 20 1 048 575 21 2 097 151 22 4 194 303 23 8 388 607 24 16 777 215 25 26 27 28 29 ■.•JcIJAAMII 30 1 073 741 823| MgCI2. Volné Mg2+ ionty ovlivňují aktivitu enzymu a zvyšují hodnotu Tm u dsDNA. ♦ Pro dosažení nejlepšího výsledku vždy stanovujeme koncentraci Mg2+ experimentálně. ♦ Optimální koncentrace může kolísat od 1 mM do 5 mM. ♦ Nejčastěji používaná koncentrace je 1,5 mM (pro 200 |iM dNTP). DNA polymeráza. ♦ Obvyklá koncentrace je 0,5 - 2,5 jednotek / 50 ui pH je dané reakčním pufrem, obvykle odpovídá pH 8,3 - 9,0. Přídatné látky mohou v některých případech ovlivnit účinnost a specifičnost PCR reakce. Jejich vliv se obvykle určuje experimentálně: ♦ albumin z bovinního séra (BSA) (100 ng/50 uJ) ♦ dimetylsulfoxid (DMSO) (2-10 % v/v) - redukce nespecifické vazby primeru ♦ detergenty (Triton X-100, Tween 20) ♦ betain (0,5 - 2 M) optimalizace PCR přídatnými látkami: ♦ želatina ♦ glycerol (1-5 % v/v) ~ ♦ spermidin ♦ protein 32 genu fága T4 —_ Minerální olej - zabraňuje vypařování během reakce BEZCHYBNOST SYNTÉZY Replikace s Taq DNA-polymerázou neprobíhá bezchybně, DNA-polymeráza příležitostně zařazuje do nově syntetizovaných řetězců chybné (nekomplementární) nukleotidy. ♦ Buňka má schopnost tyto báze odstraňovat opravnými mechanizmy. ♦ In vitro Taq DNA-polymeráze tato vlastnost chybí. Frekvence chbného začleňování za podmínek amplifikace in vitro je asi 2x104. Chybné začleňování je důležité, pokud jsou PCR produkty klonovány, neboť každý klon je odvozen z jedné molekuly DNA. Chybně začleněné báze _______............__ (mutace) potom obsahuje Kč|5|3EjEgg celé potomstvo. '^ir^Bf^Hrsflfir^HC^S Řešení problému: použití ^L^l Bakrafl dvojice DNA polymeráz, ^'SSuP^H^r^^ '.'-Tlffjpř z nichž jedna má opravné v-TJ^^a^^L^^a"^ ■ 5 1 mechanizmy (proofreading). L. jW" ■ ^L. J*I___«^^^ Základní optimalizace PCR Složka Teplota pro připojení primeru Mg Cl2 Enzym, Primer Formamid Nižší stringence Vyšší stringence Zpravidla se optimalizuje ♦ Teplota pro připojení primeru v termocykleru s teplotní gradientem ♦ Koncentrace MgCI2 Stanovení teploty pro připojení primeru ■ Teplota pro připojení primeru (annealing temperature) zkr. T, Teplota používaná pro teplotní hybridizaci molekul primeru a matricové DNA in vitro. Optimálni teplota pro připojení primeru při PCR se vypočítá podle vztahu: kde Tm Primer je hodnota Tm nejméně stabilního páru primer-matrice a Tm Produkt je hodnota Tm amplifikačního produktu. ■ Orientačně lze vypočítat Ta podle vztahu: Ta = 2(A+T) + 4(G+C) - 5 °C = Tm - 5 °C 17 Hodnota Tm ■ Tm závisí na třech základních faktorech: ♦ Zastoupení bází ♦ Složení roztoku ♦ Koncentrace solí ♦ pH ♦ Délka molekuly DNA NÁVRH PRIMERŮ PRO STANDARDNÍ PCR ♦ 18-25 bází dlouhé ♦ neobsahují vnitřní sekundární struktury ♦ obsahují 40 - 60 % G+C ♦ mají rovnoměrnou distribuci oblastí bohatých na G/C a A/T páry ♦ nejsou komplementární navzájem na 3'-koncích, takže nevytvářejí navzájem nebo samy se sebou duplexy ♦ na matricové DNA nemají falešná vazebná místa ♦ mají Tm teplotu 55 - 65 °C 19 příklady struktur vytvářených primery, které je nutné zohlednit při jejich návrhu ■ Chybně navržená dvojice primem, která vytváří stabilní duplex na 3'-konci: Správně navržená dvojice primerů, která vytváří pouze málo stabilní duplex na 5'-konci; na 3'-konci je G nebo C zaručující stabilní párování s templátem: Chybně navržený primer, vytvářející vlásenku: „HOT START" PCR „Hot-start" PCR významně ovlivňuje specifičnost, citlivost a výtěžek reakce Princip: ♦ Při „hot-start" PCR jsou určité složky reakční směsi odděleny od ostatních, dokud teplota ve zkumavce nepřekročí optimální teplotu pro připojení primem (obvykle 55 °- 65 °C). ♦ DNA polymeráza je v této nekompletní reakční směsi nefunkční. ♦ Nedochází k prodlužování nespecificky navázaných primerů během doby než je dosažena teplota Ta. Nesprávně navržený primer s falešnými vazebnými místy na templátové DNA: 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1018)3' 1 III I I I I I I I I I I I 3'(918) tttcttacccttttt-tacc (366)5' 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1018)3' II II II MIMI 3'(1191) tttgtattgcattatatacc (1210)5' 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1018)3' 1 I I I I I I I I I I I I 3'(395) tccatttttctttttatctt (111)5' Správně navržený primer, který nemá falešná vazebná místa na templátu: |5'(2476) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2152)3 1 I I I I I I I I III 3'(787)taaatctattagtttacacataacc(811)5' i'(217í CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC 152)3 ,111111 I I I I 3'(3211)caattgtaactataactgcgttatc (3235)5 i'(2176) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2152)3 I lili III I 3'(1191) gtattgcatt at at acctctgt tag (1218)5 |5'(217 CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC 2152)3 I I I I I I I I I II I 3'(1169) atattgta-tatacgaactaaatct (1192)5 Separace důležitých složek reakční směsi je dosažena některým z následujících způsobů: ♦ Manuálně ♦ Některé složky jako DNA polymeráza nebo Mg2+ jsou vynechány v původní reakční směsi a přidány manuálně po dosažení teploty > 70 °C. Nevýhodou je možnost kontaminace a možná ztráta reprodukovatelnosti. ♦ Fyzikální separace ♦ Reakční komponenty jsou rozděleny do dvou směsí, které jsou odděleny bariérou (vosková přepážka, nebo voskové korálky obsahující MgCI2). Během počáteční denaturace vosk roztaje a umožní smíchání reakčních složek. ♦ Protilátky proti DNA polymeráze ♦ Přídavek teplotně nestabilních protilátek umožní počáteční inaktivaci polymerázy. ♦ Chemická modifikace polymerázy ♦ Přídavek teplotně nestabilních látek, které se vážou na určité aminokyselinové zbytky blokují enzym (ten je potom při pokojové teplotě inaktivní). K aktivaci enzymu dochází při počáteční denaturaci („FastStart Taq DNA polymeráza"). ♦ Další inhibitory ♦ např. oligonukleotidy specificky se vázající na polymerázu DETEKCE AM PLI Fl KOVANÉHO PRODUKTU PCR Stanovení fyzikální velikosti produktu gelovou elektroforézou (agaróza, polyakrylamid). Detekce obarvením a pozorování pod UV světlem. Štěpení produktu restrikčními enzymy a posouzení spektra vznikajících restrikčních fragmentů (PCR-RFLP) Elektroforetická separace produktů za specifických podmínek pro detekci sekvenčních polymorfizmu ♦ DGGE - denaturační gradientova gelová elektroforéza ♦ SSCP - analýza polymorfizmu konformace jednořetězcových forem Příklad standardní gelové elektroforézy s produkty PCR v agarózovém gelu. 1 = hmotnostní st. 2 - 4 = produkty PCR DETEKCE AMPLIFIKOVANÉHO PRODUKTU PCR 4. hybridizací s neradioaktivně značenou sondou komplementární k části sekvence amplifikovaného úseku a detekcí enzymoimunoanalýzou v mikrotitrační destičce (PCR-EIA/ELISA), hybridizační sonda může být následně amplifikována (PCR-OLA) 5. imobilizací PCR-produktů na membráně a tečkovou hybridizací se značenými alelově-specifickými oligonukleotidy (ASO) nebo zpětnou tečkovou hybridizací s různými ASO imobilizovanými na membráně, 6. hybridizací na DNA-čipech, 7. stanovením sekvence DNA. Kontaminace při PCR Vynikající citlivost PCR může být ovlivněna kontaminací i jedinou molekulou exogénni nebo neznámé DNA. Pro minimalizaci falešných pozitivních výsledků je doporučeno: ♦ používání autoklávovaných roztoků ♦ fyzikální separace používaných PCR-reagencií od templátové DNA a PCR-produktů ♦ příprava reagencií i vzorků do alikvotních částí ♦ používání UV-světla k odstranění exogenních nukleových kyselin na pracovní ploše ♦ používání jednorázových rukavic ♦ přidávání DNA do reakce jako poslední ♦ pečlivá volba pozitivních, negativních a vnitřních kontrol Vyloučení kontaminace je důležité zejména tam, kde je potřeba použít vysokého počtu amplifikačních cyklů, aby bylo dosaženo požadovaného produktu ♦ nízkokopiových templátu DNA ♦ degradovaných vzorků. V případě pochybností je nejlepším přístupem opakování experimentu s úzkostlivou pozorností k detailům a kontrolám. Jako zdroj kontaminace DNA je nejčastěji uváděn: ♦ přenos kontaminující DNA z dříve amplifikovaných produktů PCR, ♦ vzájemná kontaminace zdrojových materiálů, ♦ kontaminace plazmidem z rekombinantního klonu, který obsahuje cílovou 27 sekvenci. Jako prevence před přenosem kontaminující DNA je v reakční směsi rutinně používána náhrada dTTP za dUTP. Následným působením uracil-N-glykosylázy na reakční směs před zahájením amplifikace. 3Q 9 £_L_ amplifikována nukleová kyselina PCR y datp, oGTP, dCTP, dUTP "c 5" S i I hybrid izace, klon ován i nebo se kve ncováni produkt PCR následující PCR Č é i LI A 3 LJ~~ T Ý T 9 je CGA s 9 u U A G A U C I uracil-N-glyko&yläza TT c ■ A G * , C 1 -1— odštěpení uracilovych zbytku I denaturace (95 °C) "c 5 a" 9 9 l rozštěpení řetězců ^X, nedochází k amplifíkaci Alternativně lze amplifikační produkty PCR inaktivovat fotochemicky pomocí derivátů psoralenu nebo isopsoralenu, Furokumarinové sloučeniny interkalující se mezi páry bází DNA. Pokud jsou tyto látky excitovány UV-světlem o vlnové délce 320-400 nm, kovalentně se vážou na nukleové kyseliny a tvoří cyklobutanové adukty s pyrimidinovými bázemi, které blokují reakci s DNA-polymerázou ©mu ■ ŘEŠENI PROBLÉMŮ PŘI STANDARDNÍ PCR Problém Možná příčina Doporučení Nevzniká produkt Nevyvážená reakce ■ Kontrola koncentrace jednotlivých složek Teplotní podmínky ■ Kontrola nastavení cyklů Nízká koncentrace templátu ■ Zvýšit koncentraci templátové DNA Koncentrace primeru nebo jeho sekvence ■ Optimalizovat koncentraci primeru ■ Navrhnout primer s novou sekvencí Různé faktory ■ Testovat reakci s pozitivní kontrolou a funkčními primery ■ Začít s novými roztoky, H20 a enzymem Nízká kvalita templátu (degradovaný, kontaminovaný, obsahující inhibitiry) ■ Použít primery, které amplifikují kratší úseky ■ Přidat pomocné látky (DMSO) ■ Optimalizovat koncentraci Mg2+ ■ Připravit nový templát ■ Zamezit častému zmrazování a rozmrazování templátu 3 3 ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PŘI STANDARDNÍ PCR Problém Možná příčina Doporučení Nevzniká produkt Nízká účinnost polymerázy ■ Používat pozitivní kontrolu ■ Zvýšit počet cyklů ■ Zvýšit koncentraci enzymu ■ Použít jinou polymerázu Produkt není čistý Vzniká sekundární amplifikační produkt ■ Kontrola koncentrace složek reakce ■ Optimalizovat koncentraci Mg2+ ■ Optimalizovat koncentraci primem ■ Snížit počet cyklů ■ Snížit koncentraci templátu Vznikají četné nespecifické produkty Nespecifická vazba primeru ■ Použít vyšší teplotu Ta ■ Optimalizovat koncentraci primem ■ Použít „hot start" ■ Narhnout nové primery 31 VYUŽITI METODY PCR 1. Základní výzkum ♦ izolace genů nebo jejich částí ♦ sekvencování DNA ♦ mutageneza in vitro ♦ modifkace konců DNA ♦ analýza (selekce) klonů z genových knihoven ♦ příprava značených sond 2. Aplikovaný genetický výzkum ♦ prenatální diagnostika (dědičných chorob) ♦ detekce mutací v genech ♦ studium polymorfizmu genů (např. RAPD) ♦ populační genetika Využití v klinických disciplinách ♦ detekce patogenních mikroorganismů (baktérií, virů, prvoků, hub) ♦ identifikace onkogenů ♦ typizace nádorů ♦ stanovení pohlaví Využití v praxi ♦ archeologie ♦ soudnictví ♦ kriminalistika