Antigeny •Základní vlastnosti 1.Cizorodost – během vývoje IK b. v kostní dřeni či v thymu se B aT lymfocyty učí rozpoznávat vlastní Ag (klonová delece). Pokud se vlastní Ag během maturace lymfocytů v prim. orgánech neobjevil, nedojde k eliminaci klonu lymfocytů, které by ho rozpoznali a reagovaly na něj. Př. Spermie • Imunogennost – schopnost indukovat i. odpověď. Čím větší fylogenetická vzdálenost mezi jedinci (při imunizaci), tím větší imunogenosti, př. Transplantace ledvin dvojčat, nepříbuzného dárce •Př. Kolagen, cytochrom evolučně konzervované molekuly – imunogennost nepatrná 2.Degradovatelnost – Pokud molekula nemůže být degradovatelná (solubilizovaná), není Ag. •Př. Ocelové jehly, klouby z umělé hmoty přijímá organismus bez reakcí. Látka rychle se rozkládající nemá stabilní fragmenty na indukci i. Odpovědi •Př. D-AK u savců nepřirozené, peptidy v organismu nedegradovatelné, po zabudování peptidu z L-AK vznik Ag •3 Vlastnosti Ag • Biochem. struktura – 1.Peptidy – výborné Ag (komplexnost, velikost, toxiny, bičíky)) 2. heterodimery glykoproteiny (buň. membrány), lipopolysacharidy (G-), proteoglykany, nekleoproteiny 3. polysacharidy- špatné Ag (škrob) 4. Lipidy – špatné Ag (strukturní nestabil) 5. NK – slabé (flexibilita) - nukleoproteiny (stabilizace) •4. Molek. hmotnost – čím vyšší, tím lepší Ag •méně jako 5000 kDa - neimunogenní •5000-10000 kDa – slabý Ag •Nad 10000 – silný Ag , obr. 2 2 •Další požadavky: komplexnost a heterogennost: •homopolymery-heteropolymery, •Př. přidání aromat. AK- zvýšení imunogennosti •4 úrovně organizace proteinů: •Primární, sekundární, terciální, kvarterní struktura •přispívají k celkové komplexnosti – zvýšení imunog. Obr. •5. Strukturní stabilita – Ag vysoce flexibilní, bez fixního tvaru – špatné Ag př. želatina, po zabudování tyrozinu, try stabilizace Vlastnosti Ag •6. Dávka a cesta vniku Ag do těla – nedostatečná dávka-stav neodpovídavosti; nízkozónová tolerance, příliš vysoká dávka – vysokozónová tolerance •Vícenásobná aplikace na dosažení potřebné i. odpovědi, způsoby vniku Ag do těla rozhoduje, který lymfatický orgán a které populace buněk se zúčastní na i. odpovědi •7. Biologické faktory – věk, hormony, genetická vybavenost pro i. odpověď, pohlaví. Př. pohlaví – ženy: odraz stimulačního vlivu estrogenů – 1. odolnost proti infekcím – žijí déle 2. vyšší hladiny Ig 3. I. odpověď na stimulaci rychlejší • Antigeny z hlediska diagnostiky Ag – schopné vyvolat I odpověď, komplexní, nekomplexní Ag, hapten, determinanty, nosič V laboratořích: Stanovení Ab proti: a)Autoantigenům b)Alergenům c)Ag infekčních činitelů d) Použití Ag pro diagnostické účely: a) nativní b) rekombinantní Adb) příprava a) chemickou analýzou b) genovým inženýrstvím (vnesením genu do vhodné bakterie) Nevýhoda: a) Čistota produktu, která není přírodě vlastní b) Shodná prim. max sekundární struktura c) Jsou –li vyšetřovaná Ab namířena proti konformačnímu epitopu, nejsou v testu detekovatelné Závěr: Testovací systémy by měly mít A) nativní i B) rekombinantní Ag •Nativní a rekombinantní Ag •Porovnávání rozpoznání Ag lymfocyty B a T •B lymfocyty nebo Ab rozpoznávají sekvenční (pořadí AK)nebo konformační epitop •(AK v sekundární struktuře), po denaturaci nerozezná, skryté AK rozezná, •hydrofilní rozezná, hydrofobní ne •Globulární proteiny-kontakt s 15-22 AK, zívisí na terciální struktuře 2 T lymfocyty •TCR Tc lymfocytů rozeznávají jen fragment rozrušené molekuly procesem uvnitř v APC buňce navázaný na MHCI (15-25AK) •TCR Th-MHCII. •Peptid – hydrofobní AK musí být ponořené do žlábku MHC, hydrofilní k TCR Experimentální imunizace •Průběh imunitní odpovědi, aplikace po třech týdnech 1.Zjištění dynamiky a výše hladiny tvorby Ig u pokusných zvířat 2.Zjištění koncentrace proteinů očkovací látky 3.Aplikace dávky při spodní hranici hodnoty množství očkovací látky 4.Aplikace po třech týdnech dle schématu 5.Izolace séra s vytvořenými Ab z pokusných zvířat Experimentální imunizace •Literatura udává jako optimální očkovací dávku rozmezí hodnot 5 – 50 mg nerozpustných proteinů v bakteriální suspenzi. Toto množství lze aplikovat nejen intraperitoneálně, ale i subkutálně. Intraperitoneální očkování je nejběžnější metodou, která se používá pro vpravení většího množství Ag do myší (Harlow, Lane 1988). •K očkování se dá použít spodní hranici hodnot Ag, aby se mohla sledovat dynamika protilátkové odpovědi, která závisí nejen na množství Ag, ale i na jeho specifitě a také na organismu, který očkujeme. sejmout0007 •Dynamika primární a sekundární protilátkové odpovědi • •Obr. Primární odpověď 1. Tvorba Ab ve třídě IgM, potom další třídy a podtřídy (IgG, IgA..) •2. Postupné zvyšování afinity Ab podle procesu somatické mutace •Sekundární odpověď 1. rychlejší a intenzivnější tvorba tříd IgG, IgA, nižší tvorba IgM •2. Vyšší afinita a množství Ab expanzí paměťových buněk, které již prodělaly proces somatické mutace Antigeny z hlediska diagnostiky Ag – schopna vyvolat I odpověď, komplexní, nekomplexní Ag, hapten , determinanty, nosič V laboratořích: Stanovení Ab proti: a)Autoantigenům b)Alergenům c)Ag infekčních činitelů d) Použití Ag pro diagnostické účely: a) nativní b) rekombinantní Adb) příprava a) chemickou analýzou b) genovým inženýrstvím (vnesením genu do vhodné bakterie) Nevýhoda: a) Čistota produktu, která není přírodě vlastní b) Shodná prim. max sekundární struktura c) Jsou –li vyšetřovaná Ab namířena proti konformačnímu epitopu, nejsou v testu detekovatelné Závěr: Testovací systémy by měly mít A) nativní i B) rekombinantní Ag •Nativní a rekombinantní Ag 2