Protilátky 1 5 •Ab model se dvěma těžkými (určují třídu a izotyp Ig) a 2 lehkými polypeptidickýmiřetězci (kappa lambda) spojené interakcí disulfidických můstků, N terminální zbytky •Nejdůležitější Vlastnosti: •Patří do gama frakce krevních bílkovin (gamaglobuliny), přítomnost některých úseků na bílkovinném řetězci-immunoglobulinové domény – konstantní a variabilní (110AK zbytků), je prototypem rozsáhlé imunologické rodiny molekul (800 důležitých molekul) •-variabilní úseky mají odlišné AK složení u různých plazmatických buněk, konstatní úseky-primární struktura C-koncových částí je • obdobná u různých molekul Ig, tvar molukuly Y odpovídá schopnosti vázat se na Ag struktury, pantovou oblastí (disulfidické můstky) se přizpůsobuje tvar vazebného místa molekule Ag (zodpovědné za prostorové uspořádání, řetězce Ig jsou glykosylovány a to umožňuje biologické vlastnosti Ab 2 • •Působením proteolytických enzymů je štěpena Ab pod (pepsin) •nebo nad (papain) disulfidickými můstky •Vzniklé proteolytické fragmenty ukazují divalenci (váží se se dvěma Ag) pepsinu a univalenci •papainu. pFc reprezentuje C-terminální konec Fc oblasti a je tvořen nekovalentními vazbami 3 4 •Variabilní a konstantní domény spolu asociují a vytváří globulární struktury, např Y •Trimer s Fc fragmenty •Zvětš. 1.000.000x •Hapten s králičími Ab vytváří •A)dimery B) trimery •C) Tetramery D) pentamery •Obr. A flexibilita v pantové oblasti •Obr. E Fc fragmenty byly natráveny pepsinem, nelze je zde pozorovat jako u obr. B v každém rohu 6 •Idealizovaná dvojrozměrná struktura Ag •a) Vazbové místo tvoří peptidické smyčky, které tvoří •hypervariabilní úseky na lehkém i těžkém řetězci •(číslo znamená počet zbytků AK) a G cukerné zbytky. •Cukerné zbytky jsou důležité pro zpětné poskládání peptidických řetězců a tvorbu beta struktury skládaného listu. Ta umožňuje, aby hypervarib. úseky ležely těsně u sebe. Díky vazbě k různým kombinacím hypervariab. úsekům a různým zbytkům uvnitř každé z této oblasti, každá z Ab může tvořit komplex s různými antigenními determinanty. • •b) Simulované kombinační místo tvoření třemi prsty každé ruky •Každý prst představuje hypervariabilní smyčky • sejmout sejmout0001 metody využívající sérologické reakce A. Precipitační metody V kapalinách V gelu B. Imunodifuzní metody •Jednoduchá imunodifúze •dvojitá imunodifúze C. Imunoelektroforetické metody Kombinace s elfo •Imunoelektroforéza podle Williamse a Grabara •Raketová imunoelektroforéza •Protisměrná •Dvojrozměrná •D. Aglutinační metody E. Hemaglutinační F. Komplementové G. Immunoblotting Zákalové reakce •Imunonefelometrie •Imunoturbidimetrie H. Imunochemické metody a) RIA b) FIA c)EIA Časové rozdělení metod •Metody I.generace •Některé techniky v roztoku – precipitační, aglutinační, KFR •Metody II.generace •Kvantitativně i složité směsi antigenu, •Imunodifúze, imunoelfo •Metody III.generace •Velmi citlivé metody, stanoví Ag, Ab i hapteny •Imunoanalýzy – př. RIA, FIA, EIA, imunoturbidimetrie •– nefelometrie, -fluorimetrie, popř jejich kombinace •Metody IV.generace •Kontinuálně měří Ag, Ab i hapteny •imunosenzory •Imunoprecipitační křivka (Ag – antigen, Ab – protilátka) •Oblast ekvivalence •Precipitační metody •Oblast nadbytku protilátky •Nekompetitivní metody • zákalové nefelometrie • turbidimetrie • s markerem EIA, IRMA.. •Oblast nadbytku antigenu •Kompetitivní metody • heterogenní RIA, ELISA.. • homogenní EMIT… • •- faktory ovlivňující precipitaci: •· typ Ab /např. IgG/ •· teplota – se zvyšující se teplotou se urychluje precipitace /např. 38°C/ •· vzájemná koncentrace Ag a Ab •· pH •· iontový náboj •· tvar a velikost části •Serologické metody - precipitace •Ag + Ab ® Ag-Ab • precipitinogen precipitin precipitát sraženina •solubilní /rozpustný/ • •- dělíme: •A) v kapalinách : •I. prstencová • – prstenec sraženiny precipitátu • • •II. sklíčková – určení pod mikroskopem •B) v gelu: •IMUNODIFÚZE • • •PRECIPITAČNÍ metody: •využití : ke stanovení Ag, Ab, H •praxe – 1. zjištění výskytu či stanovení Ab v séru při inf. onemocnění 2. identifikace patogena •Koncentrace Ab se vyjadřuje jako TITR SÉRA. • => nejmenší zředění Ab, které ještě reaguje s Ag •- hodnocení : kvalitativně – odečtení okem •· kvantitativně : •a, zjištěním množství precipitátu •b, zjištěním množství Ag v precipitátu či supernatantu •c, změna optických vlastností vzorku – 2 metody : •NEFELOMETRIE –* TURBIDIMETRIE •PRECIPITAČNÍ metody: • • př. Precipitační imunochemické metody •Screeningové metody – jednoduché precipitační testy •terénní kazetové testy pracující v oblasti ekvivalence • • • • • • • S T C S T C •Negativní výsledek Pozitivní výsledek • •Za nepřítomnosti nebo nedostatku drogy ve vzorku moče •vytvoří protilátka imunokomplex (precipitát) se značenou •drogou vázanou v místě testu T. (S – vzorek, C – kontrola) Imunodifúze •- příprava gelu: • rozvaření agarózy v pufru na vodní lázni •nanesení na skleněné destičky – ztuhnutí ve vodorovné poloze /při teplotě pod 42°C/ •- princip ID: •- vzájemná volná difúze Ab a Ag v gelu na základě koncentračního spádu až do místa střetnutí ~ zde vznikají precipitační linie®obloučky®prstence®kruhy /záleží na použitém materiálu/ •- vzniklé precipitáty detegujeme: •* okem - zákal •* barvením – Coomassie blue, amidočerň •* sekundárními protilátkami •* Au, Ag, radioizotopy •- vznik precipitátů je děj postupný!!! •- specifická reakce Ag s Ab - precipitace •/gel z agaru nebo agarózy/- AGAR ~ směs polysacharidů extrahovaných z červených mořských řas • * ® přírodní agar nutno přečišťovat ~ frakcionací vznikají 2 složky:· agaróza •- neobsahuje vedlejší aniontové skupiny - pro difúzi více vhodná •- standardnější složení než agar a nižší schopnost nespecifické adsorpce •· agaropektin •- obsahuje aniontové skupiny ® pro difúzi nevhodný Imunodifúze • •- rozdělení imunodifúzních metod: •* jednoduchá imunodifúze – gelem difunduje pouze jedna složka –Ag nebo Ab •* dvojitá imunodifúze – gelem difundují obě složky– Ag i Ab •· jednorozměrná – složka putuje v gelu jedním směrem •· dvojrozměrná /radiální/– složka putuje více směry •Ag a Ab si neodpovídají – nevytvoří se precipitační linie •Směs více typů Ag a Ab – počet linií odpovídá počtu sobě si odpovídajících párů Ab a Ag • Imunodifúze •jednoduchá imunodifúze •- migruje 1 složka: •1. složka se smíchá s gelem už při jeho přípravě (nemigruje) •2. složka se aplikuje následně do vyřezaných jamek – MIGRUJE – v místě vyrovnání koncentrací vzniká precipitační linie •Ê jednoduchá jednorozměrná imunodifúze ~ dle OUDINA •- ve spodní části zkumavky agarózový gel s Ab, převrstveno roztokem s Ag - zalito parafínovým olejem – zábrana odpařování •- čím je Ag koncentrovanější, tím dále od roztoku s Ag vznikají precipitační linie /odečitatelnější/ •- využití: · detekce počtu Ag párů •roztok s Ag •gel s Ab •olej Imunodifúze •Ë jednoduchá radiální /dvojrozměrná/ imunodifúze dle MANCINIOVÉ •- na skleněnou destičku se nalije gel, který obsahuje Ab ® nemigruje • inkubace ve vlhké komůrce ve vodorovné poloze → difúze všemi směry (radiální) • po obarvení - modré precipitační prstence •® čím je vzorek koncentrovanější – větší průměr prstence •→ změření druhé mocniny průměrů prstenců – vynesení kalibrační křivky a odečet koncentrace neznámého vzorku- •využití: •· ke kvantitativnímu stanovení Ag •· klinická praxe: stanovení koncentrace IgG, IgA, IgM, IgD, složek komplementu a proteinů akutní fáze • •jamky - vzorky: -gel s Ab •* fyziologický roztok –blank •* vzorky o neznámé koncentraci •* vzorky o známé koncentraci (kalibrační) •dvojitá imunodifúze •- gelem difundují obě složky •- koncentrace Ag a Ab musí být vzájemně ekvivalentní – proti překrývání linií •Ê dvojitá jednorozměrná imunodifúze •- ve zkumavce agarózový gel s Ab a agarózový gel s Ag •- mezi nimi čistý gel – v místě vyrovnání koncentrací se vytvoří precipitační linie- •využití: · kvalitativní důkaz Ag •· určení imunochemické příbuznosti či odlišnosti Ag • • •Imunodifúze •dvojitá radiální imunodifúze ~ dle OUCHTERLONYHO •na skleněné desky nanesen čistý gel •menší jamky – různé Ag či různé koncentrace jednoho Ag •větší prostřední jamka – Ab •koncentrovanější Ag → precipitační obloučky blíže jamky s Ab •inkubace ve vlhké komůrce •počet precipitačních linií odpovídá počtu odpovídajících si párů Ag a Ab •Využití –průkaz Ab při alergickcýh alveolitidách, průkaz Ab proti některým patogenům, např. Toxoplazma gondii •Imunodifúze Imunodifúze •- využití: •· titrace Ag – koncentrace Ag určuje umístění precipitační linie •· důkaz přítomnosti Ab •· porovnávání identity a neidentity Ag směsí ® umístění precipitační linie •Ag • •porovnání Mr (Ag) a Mr (Ab) ® určuje tvar precipitační linie • • - menší molekula se dostane dále do gelu Imunoelektroforetické metody -kombinace metod elektroforetických a imunodifúzních -Bílkoviny se dělí v závislosti na molekulové váze a elektrické náboji jednotlivých molekul. Při běžné elfo se sérum dělí na zónu albuminu, α – 1, α – 2, β, γ globulinů. Stanovení zastoupení jednotlivých frakcí může mít význam při hodnocení stádia zánětlivého procesu. Při akutních zánětech stoupá zastoupení α – 1, později i α – 2, při chronickcých zánětech dochází ke zvýšení zastoupení γ globulinů a poklesu albuminu. •imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA •RAKETOVÁ imunoelektroforéza •PROTISMĚRNÁ imunoelektroforéza •DVOJROZMĚRNÁ imunoelektroforéza •Př. imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA: •- 1953 Williams a Grabar •- 2 stupně: 1. nalití destičky ( agarózní gel s pufrem ) • vytvoření 2 žlábků a nanesení Ag mezi ně •po rozdělení elektroforézou se do žlábků 2. napipetují protilátky • inkubace 48 hodin v lednici ® dochází k DIFUZI •® v místě ekvivalence se vytváří PRECIPITAČNÍ obloučky • • • WG2 WG1 WG3 Imunoelektroforetické metody •Využití: Imunoelfo séra se v současné době používá výhradně k průkazu monoklonálního imunoglobulinu v lidském séru – paraproteinu. Je vždy produkován klonem buněk vycházející z jedné plazmatické b., mající genetickou informaci pro tvorbu jedné variabilní oblasti lehkých a těžkých řetězců a jedné třídy Ig molekuly. Na rozdíl od imunoglobulinů běžného séra s velkým mn. Různých variabilních oblastí Ig molekul. •Paraprotein se nachází. 1. u nemocných s myelomem (nádor vycházející z plazmatických buněk) 2. při jiných malignitách lymfatického systému, 3. při chronických zánětech 4. ve vyšších věk. skupinách •Vzniká neobvyklý pruh při klasické elfo séra, neboť paraprotein se pohybuje uniformně (stejný náboj a Mr). V určitém místě elektroforetického pruhu způsobí vysokou koncentraci Ig příslušné třídy. Při následné precipitaci s přidaným antisérem je v oblasti, kam paraprotein doputoval, výrazně více antigenu, precipitační linie je deformovaná a posunuta blíže ke žlábku s antisérem. Aglutinační metody •Ag + Ab ® Ag-Ab •aglutinogen aglutinin aglutinát -korpuskulární- -princip : KORPUSKULÁRNÍ / částicový / Ag •při reakci dochází ke shlukování Ag a Ab na základě vytváření můstků - Ab mezi buňkami za vzniku shluků •přímá – použití bakterií, buněk •nepřímá, pasivní – na jejich povrch je Ag uměle navázán, př.latex-fixační test, HIT •Předpoklady ke vzniku vazeb: •1. dostatek Ab, 2. přítomnost Ab proti různým epitopům 3. vzdálenost mezi částicemi co největší 4. Ab funkčně jednovazebné nevytváří aglutinaci (IgA, IgE) – inkompletní Ab viz hemaglutinace • •- hodnocení: kvalitativně - odečtení okem • kvantitativně : a, zjištěním množství aglutinátu •b, zjištěním množství Ag v aglutinátu či supernatantu • Aglutinace •využití : ke stanovení Ag, Ab, H (viz precipitační metody) 1.K určování izolovaných bakteriálních kmenů 2.K průkazu Ab proti patogenům –Widalova reakce – průkaz tyfu, paratyfu, Weil-Felixova – skvrnitého tyfu, Ab proti Francisella tularensis 3.Nepřímá k průkazu auto Ab proti štítné žláze, Ab proti autoAg – • Latexová aglutinace, latex-fixační test •rychlé kvalitativní stanovení •Ag nebo Ab imobilizován na latexových kuličkách •Stanovení Ab proti IgG – revmatoidní faktor • • • Hemaglutinační •Ag + Ab ® Ag-Ab •hemaglutinogen hemaglutin hemaglutinát •- savčí krvinky (i části) •- dochází ke shlukování krvinek, vlivem komplementu či virové částice pak dochází k LYZI. • •Ke zviditelnění aglutinačních reakcí při použití inkompletních Ab je možno použít a) aglutinaci v bílkovinném prostředí b) v prostředí s proteolytickými enzymy c) použitím antiglobulinového Coombsova séra - králičí ab proti lidským Ig • Hemaglutinace -využití: K zjišťování krevních skupin a průkaz Ab proti krevním elementům. Přímý Coombsův test – k průkazu navázaných antierytrocytárních Ab, reakce pacientových ery s Coombsovým antisérem, přítomnost navázaných Ab se projeví hemaglutinátem -Nepřímý Coombsův test – k průkazu cirkulujících antierytrocytárních Ab -1. fáze, pacinetovo sérum s ery od dárce, navázání Ab pokud jsou přítomny, vymytí, přidání Coomsova séra, které způsobí aglutinaci •při 2 reakcích: •* KFR – komlement fixační reakce •* HIT – hemaglutinačně inhibiční test : • • HIT •Patří také mezi metody serologické, založené na inhibici biologických účinků antigenů • HIT – pasivní hemaglutinace •Vycházíme ze skutečnosti, že viry (některé bakterie atd) mají schopnost se spontánně absorbovat na červené krvinky (rozpustný Ag). Ery pak aglutinují – shlukují se jen v přítomnosti specifické Ab •· odpovídá-li protilátka Ag, po přidání obalených ERY Ag se Ag vyváže a vznikne HEMAGLUTINÁT •Ab + Ag - Ery ® hemaglutinát, proběhne hemaglutinace • •· neodpovídá-li protilátka virovému Ag, nedojde k hemaglutinaci •situace, kdy přidáme stejný Ag do reakce • Ab + Ag - Ery ® hemaglutinát + stejný Ag ® Ag -Ab + Ag - Ery ® inhibice hemaglutinace •Metodou inhibice pasivní hemaglutinace lze dokázat velmi malé mn. rozpustného Ag nebo H (metoda je velmi citlivá) •pro vyhodnocení můžeme použít i optické metody • • • • • • • • • • Komplementové metody metody využívající faktu aktivace komplementového systému komplexem – antigen-protilátka, KFR • •složky reakce: Ab, Ag, C, ERY, hemolyzin •· Ab- vyšetřované sérum •- chceme v něm prokázat protilátku / komplement v séru je tepelně inaktivován / •· známý specifický Ag •- jsou-li v séru Ab, vytvoří se imunokomplex IK •· · KOMPLEMENT - zdrojem nejčastěji sérum morčete (váže se na IK a aktivuje protilátku) •hemolytický komplex: komplex Ag /beraní ERY/ a protilátky ~ EMBOCEPTORu /hemolyzinu/, získaného imunizací králičího séra beraními erytrocyty •® aby došlo k hemolýze je nutná spoluúčast KOMPLEMENTU a inkubace 30 minut při 30 °C • •průběh reakce: •* POZITIVNÍ ~ ve vyšetřovaném séru je Ab •protilátka v séru vytvoří komplex s Ag – na něj se naváže komplement. Po přidání hemolytického systému nezbývá již komplement do 2. části reakce •® k hemolýze NEDOJDE: •* NEGATIVNÍ ~ ve vyšetřovaném séru není Ab •- v 1. fázi reakce se nevytvoří IK – komplement se nevyváže a zbývá do 2. fáze reakce, kdy aktivuje hemolyzin •® DOJDE k hemolýze: •- velmi záleží na množství komplementu – každý vzorek se musí titrovat, aby bylo množství komplementu konstantní •- použití: •· diagnostika příjice /syfilis/, bruceózy, pasteurely •· ve virologii průkaz protilátek téměř všech virových nákaz •· typizace neznámých Ag nově izolovaných virů •· průkaz protiorgánových Ab Vyšetření komplementového systému •Stanovují se a)hladiny jednotlivých složek K v séru – •za pomoci antisér, většinou proti C3, C4, C1q •b) celková aktivita komplementové kaskády- •Se provádí testem CH50 – (50% hemolýza způsobená komplementem), stupeň hemolýzy závisí na množství přidaného K, nepřímá úměra •Využití: K detekci poruch nedostatečnéh mn. Nebo defektů složek K systému • •Vyšetření cirkulujících a deponovaných IK •Principy metodik •1. Využívající fyz – chem vlastností – CIK- největší makromolekuly séramohou být preciptovány pomocí PEG (polyetylénglykol). Precipitát je úměrný mn. cirkulujících CIK Vyšetření komplementového systému •2. CIK na sebe váží C1 – C3 složky K. V první fázi se odstraní nenavázaný C1q. V druhé fázi se stanoví koncentrace C1q, jež odráží i hladinu CIK (totéž pro C3,C4) •3. průkaz vazbou na buňky, které exprimují receptor pro Fc gragment IgG. Lze využít trombocyty •Využití: Pro monitoring jakýchkoliv zánětlivých procesů. Pro diagnostiku imunokomplexových chorob je důležitější průkaz IK deponovaných v tkáních. To se provádí po bioptickém odběru vzorku z tkáně (kůže, svaly, ledviny) pomocí přímé fluorescence se prokazuje uložení IgG Zákalové reakce metoda probíhající v roztoku •Princip: při reakci Ag a Ab vzniká zákal-precipitát, jehož intenzita je při konstantním množstvím mn. Ab úměrná koncentraci vyšetřovaného Ag F4k46-o494 •* NEFELOMETRIE – rozptyl viditelného světla měřeného pod úhlem *TURBIDIMETRIE – úbytek viditelného světla při průchodu vzorkem měřeného ve stejné rovině *Výhoda: možnost automatizace, rychlost provedení, přesnost, ale vyšší cena • Imunoblotting • •SOUTHERN BLOTTING • vyvinut v r. 1970, k detekci DNA, molekuly DNA se přenášejí z agarózového gelu na membránu k nalezení části sekvence DNA či konkrétního genu v genomu •NORTHERN BLOTTING •slouží k detekci RNA •přenos nám umožňuje zjistit přítomnost, nepřítomnost a relativní množství specifických RNA sekvencí •WESTERN BLOTTING •slouží k detekci bílkovin •touto metodou dokážeme najít jednu bílkovinu v množství jiných, přičemž určit i délku daného proteinu •je závislá na použití velmi kvalitních Ab zaměřených na vybranou bílkovinu •Podstatou blottingu: izolovaná látka (obvykle separovaná) se přenáší na membránu. • •Podle typu přenosu se bloty liší: •Difůzní blotting: v přenosovém pufru •Vakuový blotting: přenos pomocí vakua •Kapilární blotting: přenos kapilárními silami přes filtrační papír •Tankový elektroblotting: k přenosu využito el. pole (2-3 l pufru), na boku nádoby - elektrody •„Semi dry“ blotting: využití plošných elektrod (100 ml) •Kapkovací dot blotting: bílkoviny nejsou rozseparovány – imobilizace jednotlivých vzorků • • • •Používané membrány: •Nylonová – elektrostatická interakce •PVDF (polyvinyliden difluoridová) – hydrofilní interakce •Nitrocelulosová – hydrofilní interakce •WESTERN BLOT •3 kroky:1. SDS PAGE (gradientová elektroforéza) 2. BLOTTING 3. IMUNODETEKCE SDS PAGE •Nejpoužívanější metodou je PAGE – SDS elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS (sodium dodecyl sulphate). Umožňuje následné určení relativních molekulových hmotností jednotlivých proteinových frakcí. •Polyakrylamidové gely se připravují kopolymerací polymerů – akrylamidu a •N,N’–methylen-bis-akrylamidu (BISu). •Polymerací akrylamidu vznikají dlouhé řetězce polymerů, zařazení BISu způsobuje zesílení „můstky“, které vznikají z bifunkčních zbytků BISu. Vytvořená polyakrylamidová matice nese elektrický náboj a je chemicky dost inertní. Pro stanovení Mr se používá detergent SDS. Všechny bílkoviny vážou SDS v poměru 1,4 SDS na 1 g bílkoviny. Molekuly SDS bílkovině udělí negativní náboj. Na molekulu bílkoviny se naváže takové množství molekul SDS, že její vlastní náboj pozbude významu a dělení může probíhat podle velikosti molekul. •WESTERN BLOTTING •Blotovacím zařízením pro semi-dry blotting přeneseme rozdělené proteiny pomocí el. proudu. •IMUNODETEKCE •Inkubace s primární protilátkou a následně se sekundární protilátkou v blokovacím roztoku. •substrátového roztoku, dokud se neobjeví bandy. •Vyvolávání ukončíme namočením membrán do do vodovodní vody. • • • •Molekula určitého proteinu postupuje v gelu až do momentu, kdy velikost pórů je menší než velikost molekuly a ta se v tomto místě gelu „zasekne“. •Použitím směsi standardních bílkovin se známou Mr a po sestrojení kalibrační křivky je možné vypočítat Mr jednotlivých frakcí gel-napisy Výsledky PAGE analýzy SDS-gradient PAGE proteinový profil •Z gelu se mohou rozeznat typické rozdíly mezi • •- B. afzelii a B. garinii (linie 5, Linie 6) • •- spirochetou (linie 1) izolovanou z larvy Culex (C.) pipiens pipiens a B. afzelii (linie 2) izolovaná z imaga Culex (C.) pipiens molestus • •Legenda: Imunochemické metody •- stanovení Ag či Ab v histologických preparátech, tělních tekutinách, a jiných vzorcích, Imunoeseje, reakce třetí generace. •základem je reakce: • • • • Ag + Ab IK - imunokomplex -jeden z reaktantů nese značku a tím je vizualizován výsledek. Detekčnísystém tak zvyšuje citlivost reakce a umožňuje modifikace, které prostou precipitací reakce nejsou dosažitelné. -enzym EIA, EMIT enzyme multiplyed immunoassay technique • geneticky upravený enzym CEDIA • radioizotop RIA • fluorescenční látka FIA • chemiluminiscenční látka LIA • ü •* •Antigeny Ag– makromolekuly (polymery: proteiny, polypeptidy…) ü navozují specifickou imunitní opovědˇ ü specificky reagují s protilátkami ü hapten – nízkomolekulární látka (léčiva, drogy) navázána na • vysokomolekulární nosič •Protilátky Ab – bílkoviny (glykoproteiny) tělních tekutin ü vykazují specifickou vazebnou schopnost vůči antigenu, na jehož • podnět se vytvořily, mohou být cíleně připravené a)jen proti jedné chemické skupině b) která je společná pro více strukturně chemicky příbuzných látek moderní imunologické diagnostické metody, vznikly v 80.letech min. století vychází z poznatků imunologie, molek. biol., enzymologie, fotometrie a radiochemie •Heterogenní imunometody – separace molekul značeného reagens vázaného v imunokomplexu od volných molekul značeného reagens v roztoku (radioimunometody, ELISA) – vysoká citlivost •Homogenní imunometody – bez separace frakcí, jsou jednodušší, rychlejší, lze je automatizovat (enzymová, fluorescenční a chemiluminiscenční imunoanalýza) • • •Imunochemické metody RIA ~ radioimmunoassay •zavedena 1959 •Princip metody: spojuje jednoduchou imunologickou reakci Ag s Ab s metodikami radiochemie, která používá Ag nebo Ab značené radionuklidy •- citlivost: 10-9- 10-17 mol/l ®velmi významné, nejcitlivější •- je možné stanovovat látky i v tělesných tekutinách /krev, moč, mozkomíšní mok.../ i v pg10-12(pikogramech) •- stanovujeme jakékoliv látky, proti nimž lze vytvořit protilátku • protilátku získáme komerčně nebo injikací Ag či haptenu do králíka nebo morčete • •POSTUP: •V metodě je využito kompetice, kdy stanovený Ag a známé mn. téhož Ag značeného radioaktivním izotopem soutěží při tvorbě imunokomplexu o omezený počet vazebných míst specifické Ab (ta je v lim. množství) •Ê imunizace ~ příprava Ab: •- injekce Ag či haptenu do zvířete /králík, morče/ • - nekompletní Ag – je potřeba navázat makromolekulární nosič •Ë značení radioaktivním prvkem (Ag = X...značka) •- 3 prvky: 3H,14C,125I, 131I •- označený Ag ® Xx •Ì vlastní reakce: •- 4 složky: •Xx.................značený Ag •Ab lim60%........protilátka ze zvířete /je limitováno ~ známo její množství/ •XN.................neznámý antigen •XS.................standardní antigen •Í oddělení IK: •· imunochemické – sekundární protilátka Abs •- vyrobí se proti prvotní protilátce Ab ~ Ab pak vystupuje jako Ag •® Abs + Ab ...vznikají sraženiny IK •- izolace IK -imunochemicky – Abs, fyzikálně - filtrace, centrifugace... •molekulární metody – elektroforéza, chromatografie ... •Î vyhodnocení: •- čím více molekul X se bude v každé zkumavce nacházet, tím méně molekul Xx se bude moc navázat s protilátkou •Vyhodnocení: • •- výhody: * vysoká citlivost, specifičnost, přesnost, automatizace procesů • * mikromnožství látek přímo v bioloogických kapalinách •- nevýhody: * nakladné zařízení, drahé přístroje, drahá scintilační tekutina •* radioaktivní materiál – zdravotní riziko, γ nebo β záření, zvl. bezpečnost při práci, likvidace radioakt. materiálu • * vlastnosti radionuklidů ~ znehodnocování krátkým poločasem rozpadu – časová náročnost (musí se provést hned), u izotopů vydávajících γ záření (,125I, 131I, 75Se) je omezena expirace souprav krátkým poločasem rozpadu •využití: •využití v kriminalistice, soudním lékařství (detekce jedovatých látek), stanovování velmi malého množství látek (nízko i vysokomolekulárních) např.:kardiotonika, cytostatika (léčba infekčních onemocnění, nádorových onemocnění), hladiny hormonů, léčiv, vitamínů, drogy, minoritních složek séra, ve virologické diagnostice, vyšetření specif. autoprotilátek např. proti acetylcholinovému receptoru při myastemia gravis, •v alergendiagnostice: RAST test (radioallergensorbent test)je vyvinutý pro detekci Ab proti specifickému alergenu, RIST test (radioimmunosorbent test) je testem vyvinutým pro zjistění antigenu, Radioimunoprecipitace je pokládána za nejpřesnější metodu pro stanovení IgE v sérech FIA •Vypracována v r. 1941, uvedena do praxe v 50. letech •Princip: navázáním fluoresceinu – fluorochromu na bílkovin séra (Ag nebo Ab), podmínkou je neztratit imunologické vlastnosti. Výsledkem je spojení vysoké specifity imunologických reakcí s citlivostí průkazu fluorescence pomocí fluorescenčního mikroskopu- citlivost: 10-9- 10-12 mol/l • • fluorescenční barviva: TMRITC........tetramethylrodaminizothiokyanát •FITC ............fluorescein izothiokyanát, PE …phycoerythrin •- podstata: molekula přechází ze základního energetického stavu při absorbování energie do stavu EXCITOVANÉHO, kde je nestabilní a vyzářením energie ve formě tepla či světla (emise) se vrací zpět •- energie dodána lampou v přístroji • • vlastnosti SONDY: •* intenzita fluorescence dostatečně vysoká •* fluorescenční signál odlišitelný od pozadí •* vazba na sondu nesmí deformovat vazebné vlastnosti Ag a protilátky • nenavázané barvivo musí být lehce odstranitelné •! biologický materiál sám o sobě vyzařuje energii ® pozadí •- 2 druhy: •¬ HOMOGENNÍ • HETEROGENNÍ •- třístupňový proces u FLUOROFORŮ a FLUOROCHROMŮ •- schopny absorbovat určité množství světla /struktura – ar. kruh/ •1. FÁZE ® EXCITACE • •2. FÁZE ® DOBA EXCITOVANÉHO STAVU •- trvá 10-9s ~ velmi krátká •· konformační změna ·disipace energie ® část energie se ztrácí ·– přechází na nižší stav • •FLUORESCENCE •3.FÁZE ® EMISE •- vyzáření energie, přechází na základní stav ® vyzáření EMISNÍ ENERGIE •/~ energie emisního spektra/ •energie EXCITAČNÍ se NErovná EMISNÍ !!! •Eex> Eem h .(c/lex) > h .(c/lem) •Þ lex < lem Þ vl. délka excitační je menší než emisní •FUNKCE FLUOROFORŮ : •Mají schopnost absorbovat světlo v UV oblasti a vyzařovat ve viditelné. •Jsou vhodné k vizualizaci sledovaných objektů. Jsou látky schopné vyzařovat (emitovat přebytečnou E jako záření o vyšší vlnové délky. Na konjugaci jsou vhodné pouze fluorochromy obsahující chemickou skupinu, která se pevně váže na bílkovinu. (Specificky se váží na určité struktury v BB Þ umožní jejich zviditelnění a další analýzu ~ vyšší fluorescence = více fluoroforu = více látky v BB) •- backround fluorescence ~ fluorescence pozadí – je nežádoucí, musí se odfiltrovat •- 2 složky : · AUTOFLUORESCENCE samotného vzorku /flavony, flavoprot., NADH.../ •· REAGENČNÍ POZADÍ / fluorofor se naváže tam, kam •nemá / • •Pozitivní reakce: se jeví ve fluoresc. mikroskopu vyzařováním světla určité barvy typické pro použitý fluorochrom, zvýší se fluorescence v případě vzniku IK na rozdíl od pozadí Ag s navázaným F či jiným způsobem se upřednostní vznik signálu v případě vzniku IK •Vlastnosti sondy: •navázané barvivo musí být lehce odstranitelné •musí mít vysokou intenzitu fluorescence, •fluorescenční signál musí být dobře odlišitelný od pozadí, •vazba sondy na Ab či Ag nesmí měnit jejich imunologické vlastnosti. •heterogení techniky •homogenní techniky •Homogenní FIA •nevyžaduje separaci volného a v imunokomplexech vázaného Ag či Ab před měřením fluorescence. •Citlivost je omezována interferencí s různými látkami ve vzorku (zejména v krevním séru), malý stupeň fluorescenčních změn. •Podstata: kompetitivní princip, využívá se fluorescenční polarizace, zhášení, stupńované fluorescence, excitační přenos fluorescence, fluorescenčně značený substrát. •Heterogenní FIA •Podstata: volné označené Ag se musí oddělit od Ag vázaných v imunokomplexech ( nebo volné značené Ab od Ab v komplexech) ještě před uskutečněním měření. •Oddělení: •precipitací imunokomplexů, •použitím značeného reaktantu Ag nebo Ab vázaného v tuhé fázi •Heterogenní FIA •Mikroskopická IFA má 2 modifikace: 1. Přímá a 2. nepřímá IFA patří mezi heterog. techniky •Přímá •a) detekce Ag •Vyšetřovaná tkáň je fixovaná na sklíčku (Ag), přidáme známou značenou protilátku AbF, inkubujeme a promyjeme. Ve fluorescenčním mikroskopu pak pozorujeme pozitivitu vzorku - záření na sklíčku •╟ Ag + AbF → ╟ měření fluorescence •b) detekce Ab •známý značený Ag nebo hapten fixován na sklíčku HF nebo AgF převrstvíme vyšetřovaným sérem. Po inkubaci a promytí pozorujeme sklíčko pod fluor. mikroskopem •╟ AgF, HF + Ab → ╟ měření fluorescence •Nepřímá – průkaz Ab ve vyšetřovacím séru •Tkáň se známým Ag nebo buněčná kultura (suspenze jader. buněk) fixovanou na sklíčku převrstvíme vyšetřovaným sérem i koltrolními vzorky, následuje inkubace a promytí. Přidáme konjugát (sekund. Ab) s fluorochromem, opět inkubujeme a promyjeme a pak pozorujeme v mikroskopu •╟ Ag + Ab + AbSF →╟ měření fluorescence • • •Využití: průkaz a titrace Ab, průkaz Ag např. ANA test – protilátky proti nukleárnímu Ag (fluorescenční reakce v oblasti jader) •Přímá: k průkazu Ag v tkáňových řezech (např. deponované IK) nebo v další biolog. Vzorcích pro rychlý průkaz patogenů ve sputu či bronchoalveolární laváži •Nepřímá: k průkazu autoprotilátek jak a) orgánově nespecifických (antinukleárních Ab proti mitochondriím, hladkému svalstvu b) orgánově specifických (ab proti parietálním b. žaludku, β buňkám pankreatu, bazální membráně glomerulů, slinným žlazám a pod) • •FIA •přístroje : •· SPEKTROFLUOROMETR •- měří fluorescenci vztaženou na celý preparát •· FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP •· FLOWCYTOMETR •Fluorescenční: jako zdroj excitace využívá lampu s výbojkou pro UV záření. Obraz fluoreskujícího objektu na tmavém pozadí získáme pomocí 2 komplementárních filtrů: 1. primárního excitačního propouštějícího krátkovlnné záření a 2. sekundárního okulárového zadržujícího emitované primárním filtrem pouze viditelné záření objektu. •¬ HOMOGENNÍ:- vlastnosti: • · intenzita fluorescence se při vzniku konjugátu mění •· stanovení nízkomolekulárních látek /hapten/ - antibiotika,sedativa, hypnotika ... • · nemusíme oddělovat IK od volných reaktantů • HETEROGENNÍ:- vlastnosti: •· intenzita fluorescence se v průběhu reakce nemění •· stanovení vysokomolekulárních látek •· nutné oddělení IK od volných reaktantů •- 2 způsoby oddělování: •* PRECIPITACE ~ srážení v imunologii •- PEG ~ polyethylenglykol ® srazí se •* navázání na pevný nosič •- využití: Ê u separační FIA • Ë imunofluorescenční analýzy • • • •Testy funkce a počtu buněk IS-základní cvičení, zatím kromě CIK •a) stanovení leukocytárních (lymfoc) populací a jejich funkce •b) speciální in vitro testy-my jen část, tj testy na vyšetřování lymfocytárních funkcí, testy na proliferaci lymfocytů, test blastické transformace lymfocytů • Imunologické vyšetření •Oběr materiálu •Výsledky Imun. Vyšetření •Základy interpretace výsledků imunologických laborat. Testů viz skripta •6. přednáška: Vyšetření funkce fagocytů-základní cvičení •Vyšetření HLA-antigenů •Molekulárně biologické metody v imunologické laboratorní diagnostice (podrobně bude se přednášet jen ty metody, které nebyly probírány v jiných předmětech, spiše jen obecný přehled, ne popis metod), PCR, RT-PCR, Hybridizace, atd •a) diagnostika primárních imunodeficitů •b) diagnostika nezjistitelných i běžných onemocnění •c) diagnostika polymorfiznu imunologicky důležitých genů •d)diagnostika HLA-Ag •HLA diagnostika, ne teorie Př. Laboratoř Bioplus • •Probrat metody- rozdělení •Jednotlivé laboratoře •Které techniky na jaké druhy vyšetření