Vyšetření slin na přítomnost antigenů krevních skupin, stanovení statusu sekretora Helena Nejezchlebová (helanej@sci.muni.cz) Alena Žákovská Ústav experimentální biologie PřF MU Cíle cvičení ›student si zopakuje/naučí se základní informace o krevním systému AB0 › ›student prakticky provede stanovení antigenů krevního systému AB0 na biologickém materiálu a určí status sekretora › ›studenti zhodnotí výskyt sekretorů (vylučovatelů) a nesekretorů (nevylučovatelů) ve skupině studentů › Teorie Antigeny systému AB0 (H) se v lidském organismu vyskytují ve dvou formách: a)Ag jsou vázány na membrány téměř všech buněk těla, včetně erytrocytů; b)tvoří metabolický produkt první skupiny: ve vodě (tělních tekutinách) rozpustné Ag přítomné přibližně u 77% lidské populace. Metabolická přeměna je řízena geny Se/se, zcela nezávislými na genech AB0 určujících příslušnost ke krevní skupině. Kombinace alel sese zajistí dokonalý rozklad vázaných Ag a tedy nepřítomnosti Ag v tělních tekutinách. Tito jedinci se označují jako nevylučovatelé (nonsekretoři). Jedinci s dominantní alelou Se v genotypu mají Ag přítomny v tělních tekutinách a označují se vylučovatelé (sekretoři). Metodika adsorpčně inhibiční metoda (AI) ›založená na inhibice hemaglutinace › ›vysycení vazebných míst na Ag ve slinách přidáním Ab/diagnostika vhodného titru a následné stanovení množství nenavázaných Ab přidáním suspenze odpovídajících erytrocytů. Intenzita aglutinace je nepřímo úměrná množství skupinových substancí ve slinách. › —AI má 2 fáze: —1. absorpce: k vyšetřovanému vzorku (antigenu) se dodá známé množství Ab, dojde k vazbě Ab-Ag. — 2. aglutinace: v této fázi je zjišťována kvantita nenavázaných Ab poklesem jejich titru. Pokles se projeví inhibicí aglutinace přidaným náplavem známých krvinek o známém objemu a koncentraci. — —použití: hemaglutinačně inhibičního testu se hojně užívá k průkazu slabých A a B aglutinogenů a při zjišťování AB0 antigenů v buňkách lidských tkání (i např. u historického kostního materiálu), ve spermiích, na leukocytech, trombocytech a v krevních skvrnách. •Adsorpčně inhibiční metoda: principem je inhibice hemaglutinace Materiál, postup ›monoklonální diagnostika (EXBIO Olomouc): anti-A (IgM, 1:8), anti-B (IgM, 1:32), anti H (IgM, 1:20) ›5% suspenze diagnostických erytrocytů A,B,O ve FR; v případě stanovení KS 0 upravených bromelinem ›FR 0,85% (0,15 mmol/l) NaCl ›vodní lázeň na 100 °C, centrifuga, zkumavky (typu EPPENDORF = EPP, aglutinační = AGLU), rukavice!, destičky pro odečítání výsledků, … › › ›Zpracování slin: ›1. Sliny ve skleněné zkumavce (asi 2 ml) zahřejeme 10 minut ve vodní lázni při 100 °C (inaktivace enzymů, aby nedošlo k natrávení, a tím snížení množství skupinových substancí. Varem ztratí sliny svou vazkost, stávají se tekutějšími a lépe se zpracovávají) 1. ›2. Centrifugace slin při 2000 ot./min po dobu 5 minut (tím se odstraní koagulovaný hlen a buněčný detrit, EPP). › ›3. Čirá tekutina se ze supernatantu pipetuje do zkumavky (EPP). — • •4. Sliny naředíme fyziologickým roztokem 1:100 (EPP). • •5. Připravíme 3 řady AGLU zkumavek (A, B, H) po 4 zkumavkách. • •6. Do první a druhé zkumavky v každé řadě dáme po 30 µl naředěných slin. • •7. Do všech zkumavek kromě prvních (tzn. do 2., 3. a 4.) pipetujeme 30 µl FR. • •8. V řadě A provedeme titraci 30 µl s ředicím koeficientem 2: • a) obsah 2. zkumavky promícháme, přeneseme 30 µl do 3. zkumavky, promícháme, •b) přeneseme 30 µl do 4. zkumavky, promícháme a odebereme 30 µl i z této poslední zkumavky. • •9. Totéž provedeme pro řady B a H. Výsledná ředění slin ve zkumavkách jsou 1:100, 1:200, 1:400 a 1:800. ›10. U kontrolních zkumavek se sliny nahrazují FR/slinami se známou krevní skupinou. › ›11. Do 4 zkumavek řady A přidáme po 20 µl diagnostika anti-A 1:8, do zkumavek řady B po 20 µl diagnostika anti-B 1:32, do zkumavek řady H po 20 µl diagnostika anti-H 1:20. › ›12. Promíchat a ponechat při laboratorní teplotě po dobu 20 minut. › ›13. Poté přidáme 20 µl 5% suspenze erytrocytů, vždy příslušných danému diagnostiku, tzn. do zkumavek řady A erytrocyty skupiny A atd. › ›14. Zkumavky jemně promícháme a necháme 10 minut odstát při laboratorní teplotě. › ›15. Centrifugace všech zkumavek při 1000 ot./min. po dobu 1 minuty. Protřepat a centrifugaci opakovat. › ›16. Po centrifugaci jsou zkumavky připraveny k hodnocení. › › obr2sliny •Schéma vyšetření: pro každý antigen 4 ředění slin 30 µl slin 1:100 20 µl antiA 1:8 20 µl ery A 5% 30 µl slin 1:200 20 µl antiA 1:8 20 µl ery A 5% 30 µl slin 1:400 20 µl antiA 1:8 20 µl ery A 5% 30 µl slin 1:800 20 µl antiA 1:8 20 µl ery A 5% 30 µl slin 1:100 20µl antiB 1:32 20µl ery B 5% 30 µl slin 1:200 20 µl antiB 1:32 20µl ery B 5% 30 µl slin 1:400 20 µl antiB 1:32 20 µl ery B 5% 30 µl slin 1:800 20 µl antiB 1:32 20 µl ery B 5% 30 µl slin 1:100 20 µl antiH 1:2 20 µl ery 0 5% 30 µl slin 1:200 20 µl antiH 1:2 20 µl ery 0 5% 30 µl slin 1:400 20 µl antiH 1:2 20 µl ery 0 5% 30 µl slin 1:800 2 0µl antiH 1:2 20 µl ery 0 5% Hodnocení výsledků › Výhodou AI testu je, že negativní výsledek je dán přítomností aglutinace, a tudíž máme kontrolu, že jsme umístili do zkumavek sérum a erytrocyty stejné specifičnosti. › ›Je-li ve vyšetřovaných slinách vyšetřovaný antigen a přidané erytrocyty se neshlukují, značí to, že antigen slin vysytil diagnostický titr aglutininu → jde o sliny vylučovatele. › › Jde-li o sliny nevylučovatele, přidané krvinky jsou diagnostikem aglutinovány. › ›Při vizuálním hodnocení se zaznamená pro každou zkumavku stupeň aglutinace podle následujících pravidel: — —++++ kompletně shluklý kompaktní sediment —+++ sedimentované erytrocyty se po jemném poklepání na dno zkumavky rozdělí na 2-4 nepravidelné hrudky —++ sediment se rozpadne na víc drobných částí —+ sediment zůstane po poklepání na dno zkumavky ve tvaru jemně zrnitého písku —- negativní reakce, sedimentované erytrocyty se volně zvíří ve fyziologickém roztoku