Stanovení ALT (Alaninaminotransferáza) v séru člověka


Teorie: Aminotransferázy jsou enzymy usnadňující přeměnu jedné aminokyseliny v jinou. Tím pomáhají
udržovat vyvážený přísun aminokyselinových jednotek potřebných pro syntézu bílkovin. Zvýšená
aktivita alaninaminotransferázy je významným indikátorem aktivity jater, srdce a kosterního
svalstva.

V praxi jsou transaminázy látky tělu vlastní, které se obvykle nacházejí v buňkách. ALT
transamináza je obsažena převážně v buňkách jater, srdce, kosterních svalů, ledvin, mozku a
v červených krvinkách Po jejich rozpadu přecházejí do krevního séra. Zvýšená hodnota ALT znamená
tedy zvýšený rozpad buněk v těchto oblastech.

Norma: 0,06 – 0,14 ukat/l

Hraniční hodnota: 0,42 ukat/l


Úkol: Stanovit ALT v séru člověka

Pomůcky: stojánek na eppenndorfky

                   nastavitelné pipety

                   termolázeň  na 37^oC

                   ELISA-reader s filtrem o vlnové délce 340 nm


Princip metody: alaninaminotransferáza (L-alanin: 2-oxoglutarátaminotransferasa E.C.2.6.1.2)
katalyzuje reakci mezi L-alaninem a 2-oxoglutarátem, které převádí na L-glutamát a pyrohroznan,
Stanovení je založeno na měření absorbance hydrazonů kysein 2-oxoglutarové a pyrohroznové
v alkalickém  prostředí. Hydrazon kyseliny pyrohroznové má vyšší absorbanci.


L-alanin + oxoglutarát ® pyruvát + L-glutamát

Pyruvát + NADH + H^+ ® laktát + NAD^+

Katalytická koncentrace ALT je úměrná poklesu absorbance při 340 nm.


Činidla

1. Enzym:

Pufr: Tris pufr pH=7,5, L-alanin, LD

LD ³ 2,5 mkat

NADH ³ 21,6 mmol/lahvičku


2. Startér

2-oxoglutarát 180 mmol/l

Azid sodný 0,1 %


3.Tlumivý roztok – substrát

Tris 120mmol/l

L-alanin 800mmol/l

Azid sodný 0,1%


4. Aktivátor

Pyridoxal-5-fosfát 6 mmol/tabletu


Kalibrace

BIO-LA-TEST LYONORM KALIBRÁTOR, kat. č. 10003200 (1,36 mkat/l), 3204,3206


Příprava pracovního roztoku

25% hmotnosti obsahu lahvičky s činidlem 1 se rozpustí v 25ml roztoku činidla 3. Po rozpuštění se
přidá půl tablety činidla 4.  Propočítat na množství vzorků a podle toho připravit množství prac.
roztoku.

Postup analýzy

Vzorky: nehemolytické sérum, heparinizovaná nebo EDTA plazma

Vlnová délka: 340 nm

ELISA destička

Teplota: 37 °C



pracovní roztok

                          100 ml


sérum vzorku nebo kontroly

                          10 ml



Promíchá se a inkubuje 10 minuty při 37 °C

Přidá se činidlo 2 v množství 10µl



Promíchá se, inkubuje se 2 a minuty při 37 °C měří se absorbance v 1 minutových intervalech nejméně
po dobu 3 minut. Vypočte se průměrná změna absorbance za 1 min (A).

A= průměr (A1+A2+A3).

Referenční hodnoty:

ALT µkat/l 37ºC

Muži 0,2-0,8

Ženy 0,2-0,6

Každá laboratoř má svou hodnotu, která se může mírně lišit.

Hodnotu vzorku porovnat s hodnotou standardu.