Protokol

Imunodifuze podle Ouchterlonyho

Materiál: gel (1,2% agarosa), Borat-fosfátový pufr, automatické pipety, sklíčko, inkubátor,
fyziologický roztok, destilovaná voda, varné sklo, vařič, protilátky Ab (SwaHu: Swine antibody
against Human serum, HAHu: Horse Antibody against Human serum), antigeny Ag (Lyonorm, Human control
serum), mikrozkumavky typu Eppendorf

Teorie: Imunodofúze je jednou z nejstarších imunochemických metod. Dnes tuto metodu nahradily
v rutinních laboratořích automatizované systémy nefelometrické a turbidimetrické. Výhodou této
metody je velká jednoduchost, nevýhodou velká pracnost, vyžaduje určitou zručnost a má poměrně
omezený rozsah při kvantitativním měření. Princip metody je založen na tvorbě komplexů
antigen-protilátka v prostředí agarozoveho gelu po difuzi.

Existuje několik modifikací této metody: např. podle Ouchterlonyho a podle Manciniové, jež jsou
nejčastěji využívány.

Modifikace podle Manciniové je založena na radiální difuzi antigenu v gelu s rozpuštěnou
protilátkou nebo na radiální difuzi protilátky v gelu s rozpuštěným antigenem. V gelu vznikají
precipitační prstence. Gel se nechá ve vodní lázni vytemperovat na teplotu 56°C, aby nedošlo
k denaturaci protilátky. Následně se přidá protilátka, která se důkladně vmíchá do gelu
(kvalitativní i kvantitativní).

Modifikace podle Ouchterlonyho je založena na difuzním protisměrném pohybu molekul antigenu a
protilátky. V místě setkání antigenu a protilátky vzniká v gelu precipitát, který je důkazem
přítomnosti hledaného antigenu nebo protilátky (kvalitativní stanovení).

Cíl: Připravit precipitační linie určité intenzity v gelu po difuzi protilátky a antigenu a popsat
děj precipitace.

Postup:

1.      Připravte 1,2% agarosový gel ve vodní lázni (agarosa + borat-fosfátový pufr) 6ml/dvojice

2.      Očistěte sklíčka 95% etanolem

3.      Automatickými pipetami opatrně napipetujte gel na sklíčko (2,4ml na sklíčko) a nechte gel
ztuhnout

4.      Pomocí odsávačky a šablony vytvořte v gelu jamky podle obrázku č.1

5.      Připravte si ředění antigenu do krajových otvorů 1:0, 1:2, 1:4, 1:8 a 1:16

6.      Napipetujte 64µl protilátky do centrální jamky a 32µl antigenů v určitém ředění do krajních
jamek podle obrázku č.1. Ouchterlonyho destička

7.      Nechte inkubovat při lab. teplotě 24-48 hodin

8.      Operte skla ve fyziologickém roztoku (nejvýše 2min), dále by se měla skla několik dní sušit
pro dlouhodobé uchování gelu, což my nepotřebujeme, takže sušení vynecháme

Barvení

9.      Barvěte amidočerní (75ml CH₃OH, 8ml CH₃COOH, 0,08g amidočerni), pak promyjte
v diferenciačním roztoku (CH₃OH : CH₃COOH = 10:1)

10.  Nakonec promyjte v dest. vodě

          Obr. č. 1:  Ouchterlonyho destička

Vyhodnocení:      Pokud odpovídá hledaný antigen Ag protilátce Ab, vznikne precipitační linie a
naopak. Ředění Ag a Ab jsou ekvivalentní tehdy, nachází-li se precipitační linie uprostřed mezi
jamkami Ag a Ab.