ZÁKLADNÍ PRINCIPY ANALÝZY OBRAZU Příklady analýzy obrazu Radek Fedr Credit: Dr Jônatas Bussador do Amaral (Dr Gláucia Maria Machado Santelli) | Nikon Small World ISO ChK1 Specifický ChK1 78.436 jader 33.321 jader ANALÝZA TKÁNÍ § 16 tkáňových řezů (8 ISO + 8 specifické) § 23,3 GB dat obrazů § 200 zorných polí/řez § 5 684 588 jader § 1,5h analýza obrazů § 36 parametrů/jádro § 40 GB dat celkem OBRAZOVÁ CYTOMETRIE § Pixel § Intenzita - pixel § Distribuce § Obraz, Projekce § Graf, Model § Tracking/Sledování PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE § Pulz § Intenzita - částice § Distribuce § Histogram/Bodový graf § End-point SROVNÁNÍ Příprava vzorku POSTUP Snímání Uložení dat Zpracování Analýza Vyhodnocení dat PŘÍPRAVA A SNÍMÁNÍ § živé § fixované § 2D § 3D Vzorek Mikroskopie §průchozí světlo §fázový kontrast §fluorescence §konfokální §holografická §elektronová § suspenze § monovrstvy § kokultivace § tkáň § sferoidy § organoidy • Experiment PŘÍPRAVA A SNÍMÁNÍ § podložní sklo § ztenčené dno § více-jamkové desky Plast Rozlišení § objektiv § bitová hloubka § počet barev Grey levels Grey levels §Příprava vzorku §Automatické §Hledání §Zaznamenání §Popis §Vyhodnocení §Automatické §Automatické §Automatické SNÍMÁNÍ “THE FIRST RULE OF ANY TECHNOLOGY USED IN A BUSINESS IS THAT AUTOMATION APPLIED TO AN EFFICIENT OPERATION WILL MAGNIFY THE EFFICIENCY. THE SECOND IS THAT AUTOMATION APPLIED TO AN INEFFICIENT OPERATION WILL MAGNIFY THE INEFFICIENCY.” Bill Gates OBRAZ 2D tabulka pixelů HISTOGRAM – BITOVÁ HLOUBKA 8 bit Grey levels 16 bit Bitová hloubka Grey levels ImageJ: Analyze → Histogram Image → Type Histogram Originální obrázek HISTOGRAM – REKONSTRUKCE OBRAZU Histogram HISTOGRAM – DYNAMICKÝ ROZSAH Originál Histogram stretching Velký dynamický rozsah Krátká expozice Dlouhá expozice Malý dynamický rozsah Originál Odstranění pozadí ImageJ: Image → Adjust → Brightness/Contrast HISTOGRAM & LUT – LOOKUP TABLE Jak LUT funguje Intenzita na vstupu 255 0 255 ImageJ: Image → Lookup Tables → Invert LUT/Green HISTOGRAM & LUT – PŘÍKLADY Vstup 255 255 0 Vstup 255 255 0 Vstup 255 0 255 Jas Kontrast Žádná změna Gama korekce ImageJ: Image → Adjust → Brightness/Contrast HISTOGRAM - ŠUM Gaussovský Sůl & Pepř Blur filtering Median filtering ImageJ: Process → Filters → Gaussian Blur/Median DATOVÉ FORMÁTY Tvar složený z geometrických objektů Jemná struktura Diagramy, schémata, grafy, ilustrace Typické formáty: SVG, DWG, CDR, WMF Vektorové obrazy Rastrové obrazy Tvar reprezentovaný maticí pixelů Pixelace Fotorealistické obrazy Typické formáty: JPEG, GIF, TIFF, PNG DATOVÉ FORMÁTY – RASTROVÁ GRAFIKA Fotky a realistické obrazy Ztrátová komprese Jemné, pozvolné přechody Nepodporuje transparentnost Joint Photographic Expert Group (JPEG) Portable Network Graphics (PNG) Grafika, obrazy s textem, fotky Bezeztrátová komprese Velké oblasti sytých barev, ostré přechody Nepodporuje Non-RGB barevný prostor(CMYK) ImageJ: File → Save As → PNG/Jpeg DATOVÉ FORMÁTY – RASTROVÁ GRAFIKA Fotky, grafika Možnost bezeztrátové komprese Profesionální, široce podporovaný Různé barevné prostory, jakékoli rozlišení a barvy Tagged Image File Format (TIFF) Graphic Interchange Format (GIF) Grafika, loga, animace Bezeztrátová komprese Velké oblasti sytých barev, ostré přechody 8bits/pixel, 256 barev z 24bit RGB prostoru ©EMBL ImageJ: File → Save As → Gif/Animated Gif/Tiff/Compressed TIFF ZPRACOVÁNÍ – BODOVÉ TRANSFORMACE g=T(f) Vstup 255 255 0 Vstup 255 255 0 +30 x 5 ImageJ: Image → Adjust → Brightness/Contrast FILTROVÁNÍ – LOKÁLNÍ ZMĚNY © 2015 Stack Exchange Inc ImageJ: Process → Sharpen/Filters → Unsharp Mask FILTROVÁNÍ – PŘÍKLADY doostření rozmazání detekce hran dekonvoluce ImageJ: Process → Sharpen/Smooth/ Find Edges Plugins → Parallel Iterative Deconvolution kx FILTROVÁNÍ – GLOBÁLNÍ TRANSFORMACE Konvoluce = Násobení 0 frekvence x ImageJ: Process → FFT → FFT Fast Fourier Transformation Vzdálenost OBRAZOVÁ ARITMETIKA Sčítání + = + = ImageJ: Process → Image Calculator OBRAZOVÁ ARITMETIKA + = - = ImageJ: Process → Image Calculator OBRAZOVÁ ARITMETIKA x = / = ImageJ: Process → Image Calculator OBRAZOVÁ ARITMETIKA AND = OR = ImageJ: Process → Image Calculator OBRAZOVÁ ARITMETIKA – PŘÍKLADY / = Flat Field korekce Gaussian blur ImageJ: Process → Filters → Gaussian Blur → Save As Process → Image Calculator OBRAZOVÁ ARITMETIKA – PŘÍKLADY = Segmentace Maska AND ImageJ: Image → Adjust → Threshold → Save As Process → Image Calculator SEGMENTACE – MANUÁLNÍ Originální obraz Prahování Maska ImageJ: Image → Adjust → Threshold SEGMENTACE – POLOAUTOMATICKÁ Start - ROI Level sets Konec Maska ImageJ: Plugins → Segmentation → Level Sets SEGMENTACE – POLOAUTOMATICKÁ ImageJ: Plugins → Segmentation → Level Sets SEGMENTACE – STROJOVÉ UČENÍ Učení malováním Maska Originální obraz Kontrola a oprava Ilastik: Pixel Classification → Input Data → Feature Selection → Training → Prediction Export SEGMENTACE – AUTOMATIZOVANÁ Originální obraz Otsu - Klastrování Segmentovaný obraz Intra-class variance minimal ImageJ: Image → Adjust → Threshold → Otsu ZMĚNA MORFOLOGIE MASKY Eroze Roztažení Zavření Otevření + Structuring element ImageJ: Process → Binary → Make Binary Process → Binary → Dilate/Erode/Open/Close ZMĚNA MORFOLOGIE MASKY Originální obrazy Prahování Watershed Voda stéká do údolí ImageJ: Process → Binary → Make Binary Process → Binary → Watershed SEGMENTACE – 3D MODELOVÁNÍ Originální obraz Oprahovaná jádra 3D projekce ImageJ: Image → Adjust → Threshold → Otsu Plugins → 3D Viewer ANALÝZA - SOFTWARE CellProfiler MD Metaxpress LAS X FIJI / ImageJ Ilastik Icy OBRAZOVÁ ANALÝZA - STEREOLOGIE Velikost pixelu Plocha Intenzita (bitová hl.) Textura Morfologie x y ImageJ: Image → Properties Analyze → Analyze Particles PROBLÉMY § Doba snímání § Kvalita obrazů § Ukládání velkých obrazů § Postup analýzy § Výběr parametrů § Statistika § Vizualizace § § Titrace, výběr protilátky, fluorochrom, fixace § Rubish in rubish out § 100Mbit/s § Znalost SW a postupů zpracování obrazu § Odborné články § Výběr správného testu §Výběr SW, Statistica, SPSS, R § § > APLIKACE Příklady analýz POČÍTÁNÍ BUNĚČNÝCH KOLONIÍ § Hightroughput § Průchozí světlo § Velikost kolonie/plocha § Klonogenní kapacita KVANTIFIKACE POVRCHOVÝCH MARKERŮ § Hightroughput § Jednotlivé buňky § Průchozí světlo + Fluorescence § Plasticita TROP-2 § Automatizovaná procedura § Zpracování dat - histogram DETEKCE SFEROIDŮ A INVAZIVITY § Hightroughput § Průchozí světlo § Detekce sferoidů § Detekce invadujících buněk § Plocha ANALÝZA TKÁNÍ § Hightroughput § Barevný obraz § Fluorescence § Detekce jader § Kvantifikace intenzity § Zpracování dat - R ANALÝZA A KVANTIFIKACE MORFOLOGIE IMAGEJ http://imagej.nih.gov/ij/ FIJI http://fiji.sc/ CELLPROFILER http://www.cellprofiler.org/ ILASTIK http://ilastik.org/ DĚKUJI ZA POZORNOST 28.11.2017 Radek Fedr fedr@ibp.cz radek.fedr@fnusa.cz